本发明专利技术提供一种黄酮
【技术实现步骤摘要】
黄酮-8-羟化酶及其在8-羟基黄酮化合物合成中的应用
[0001]相关申请的交叉引用
[0002]本申请要求2019年12月26日提交的申请号为201911369033.2的中国专利技术专利申请的优先权和权益，其整体内容通过引用的方式纳入本文。
[0003]本专利技术涉及生物
，具体地，本专利技术涉及黄酮-8-羟化酶及其在8-羟基黄酮化合物中的应用。
技术介绍
[0004]黄酮-8-羟化酶(F8H)最早在菊科植物(Chrysanthemum segetum)的花瓣中发现，在NADPH和FAD存在的情况下，它可以催化黄酮醇和黄酮的8位羟基化。此外，2014年Berim等在紫花罗勒中分离出一种Rieske类型的黄酮8位羟化酶，它可以将三裂鼠尾草素或者蓟黄素(crisimaritin)转化为8-羟基三裂鼠尾草素或者8-羟基蓟黄素。Zhao等在2017年报道一种来自黄芩的F8H，它可以催化白杨素的8位羟基化，但是效率非常低。
[0005]唇形科植物半枝莲中含有丰富的汉黄芩素以及汉黄芩苷，汉黄芩素是由白杨素经过8位羟基化和甲基化修饰后得到的一类具有抗肝癌活性的化合物。但是，目前尚无半枝莲来源的黄酮8-羟化酶的相关报道，因此本领域迫切需要筛选一类高效的黄酮-8-羟化酶，开发一种天然合成汉黄芩素的方法。
技术实现思路
[0006]本专利技术提供一种高效的黄酮-8-羟化酶，并提供一种8-羟基黄酮化合物合成的方法。
[0007]本专利技术提供如下技术方案：
[0008]第一方面，本专利技术提供一种黄酮-8-羟化酶，其选自以下组：
[0009](a)具有SEQ ID NO:1或2或3所示氨基酸序列的蛋白；
[0010](b)由SEQ ID NO:1或2或3所示氨基酸序列经过一个或数个，优选1-50个，更优选1-30个，还要优选1-10个，最优选1-6个氨基酸残基的缺失或添加而形成的且具有(a)所述蛋白功能的衍生蛋白；例如是在SEQ ID NO:1或2或3所示氨基酸序列的C末端和/或N末端添加或缺失一个或数个，优选1-50个，更优选1-30个，还要优选1-10个，最优选1-6个氨基酸残基而形成的且具有催化黄酮类化合物8位羟基化活性的衍生蛋白；或者
[0011](c)氨基酸序列与SEQ ID NO:1或2或3所示氨基酸序列具有同源性≥50％(例如≥70％、再例如≥90％)，且具有催化黄酮类化合物8位羟基化活性的衍生蛋白。
[0012]在一个实施方案中，所述(b)是由(a)的氨基酸序列添加标签序列、信号序列或分泌序列后所形成的融合蛋白。
[0013]在一个实施方案中，所述黄酮-8-羟化酶是来源于半枝莲或猴面花。
[0014]第二方面，本专利技术还提供一种分离的多核苷酸，所述多核苷酸包括选自以下组的
核苷酸序列：
[0015](a)编码如SEQ ID NO:1或2或3所示蛋白的核苷酸序列；
[0016](b)SEQ ID NO:4或5或6所示的核苷酸序列；
[0017](c)SEQ ID NO:4或5或6所示的5
’
端和/或3
’
端截短的核苷酸序列或者添加核苷酸所形成的核苷酸序列；
[0018](d)与SEQ ID NO:4或5或6所示核苷酸序列具有同源性≥50％(例如≥70％、再例如≥90％)的核苷酸序列；
[0019](e)上述(a)-(d)任一核苷酸序列互补的核苷酸序列。
[0020]在一个实施方案中，所述(e)所述的核苷酸序列与(a)-(d)任一核苷酸序列完全互补。
[0021]在一个实施方案中，所述SEQ ID NO:4或5或6所示的核苷酸序列分别编码SEQ ID NO:1或2或3所示的蛋白。
[0022]第三方面，本专利技术进一步提供一种载体，所述载体含有本专利技术所述的多核苷酸。
[0023]在一个实施方案中，所述载体是可以在酵母菌种表达的载体，所述载体选自细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒或其他载体，例如YCp系列载体、YEp系列载体、YIp系列载体、pCS系列载体、pRS系列载体。
[0024]第四方面，本专利技术还提供一种重组的宿主细胞，其包括如第二方面所述的多核苷酸。
[0025]在一个实施方案中，所述重组的宿主细胞包括本专利技术第三方面所述的载体，或者其基因组中整合第二方面所述的多核苷酸。
[0026]在一个实施方案中，所述重组的宿主细胞是来源于原核细胞或真核细胞，例如是真菌或者细菌细胞；具体地，所述宿主细胞可以是酿酒酵母或者大肠杆菌。在一个实施方案中，所述重组的宿主细胞具有表达黄酮-8-羟化酶的能力。
[0027]在一个实施方案中，所述重组的宿主细胞还进一步包含编码C8位甲基化酶的核苷酸序列。
[0028]第五方面，本专利技术提供本专利技术所述黄酮-8-羟化酶或所述载体或所述重组的宿主细胞的用途，其用于催化黄酮类化合物8位碳的羟基化反应。
[0029]在一个实施方案中，所述黄酮类化合物选自白杨素、芹菜素、山奈酚中的至少一种。
[0030]在一个实施方案中，所述黄酮-8-羟化酶催化白杨素8位碳的羟基化反应，生成去甲汉黄芩素。
[0031]在一个实施方案中，所述黄酮-8-羟化酶催化芹菜素8位碳的羟基化反应，生成异野黄芩素。
[0032]在一个实施方案中，所述黄酮-8-羟化酶催化山奈酚8位碳的羟基化反应，生成8-羟基-山奈酚。
[0033]第六方面，本专利技术提供一种8-羟基-黄酮化合物的制备方法，包括将本专利技术所述黄酮-8-羟化酶与底物接触，催化底物的C8位点发生羟基化反应，制备8-羟基-黄酮化合物，其中所述底物为黄酮类化合物。
[0034]在一个实施方案中，所述黄酮类化合物选自白杨素、芹菜素、山奈酚中的至少一
种。
[0035]在一个实施方案中，所述8-羟基-黄酮化合物为去甲汉黄芩素、异野黄芩素或8-羟基-山奈酚中的至少一种。
[0036]在一个实施方案中，所述制备方法包括制备所述黄酮-8-羟化酶的步骤，例如将第四方面所述的重组的宿主细胞进行培养，制备所述黄酮-8-羟化酶。在一个具体实施方案中，可以从培养液中分离所述黄酮-8-羟化酶，或者在培养液中加入底物进行反应。
[0037]在一个实施方案中，所述制备方法包括发酵培养重组的酿酒酵母菌株，并在发酵培养基中加入所述底物进行发酵培养，制备所述8-羟基-黄酮化合物。
[0038]本专利技术还提供一种以葡萄糖为底物制备汉黄芩素的方法，包括培养重组的宿主细胞，并加入葡萄糖进行反应，其中所述重组的宿主细胞可表达如第一方面所述的黄酮-8-羟化酶和C8位甲基化酶。
[0039]在一个实施方案中，所述重组的宿主细胞具有如第四方面所述的含义。
[0040]有益效果：
[0041](1)本专利技术首次提供了半枝莲、猴面花、黄芩来源的黄酮-8-羟化酶，并发现半枝莲、猴面花、黄芩来源的黄酮-8-羟本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种黄酮-8-羟化酶，其选自以下组：(a)具有SEQ ID NO:1或2或3所示氨基酸序列的蛋白；(b)由SEQ ID NO:1或2或3所示氨基酸序列经过一个或数个，优选1-50个，更优选1-30个，还要优选1-10个，最优选1-6个氨基酸残基的缺失或添加而形成的且具有(a)所述蛋白功能的衍生蛋白；例如是在SEQ ID NO:1或2或3所示氨基酸序列的C末端和/或N末端添加或缺失一个或数个，优选1-50个，更优选1-30个，还要优选1-10个，最优选1-6个氨基酸残基而形成的且具有催化黄酮类化合物8位羟基化活性的衍生蛋白；或(c)氨基酸序列与SEQ ID NO:1或2或3所示氨基酸序列具有同源性≥50％(例如≥70％、再例如≥90％)，且具有催化黄酮类化合物8位羟基化活性的衍生蛋白。2.根据权利要求1所述的黄酮-8-羟化酶，所述序列(b)是由(a)添加标签序列、信号序列或分泌序列后所形成的融合蛋白。3.根据权利要求1或2或3所述的黄酮-8-羟化酶，所述黄酮-8-羟化酶是来源于半枝莲或猴面花。4.一种分离的多核苷酸，所述多核苷酸包括编码权利要求1-3任一项所述黄酮-8-羟化酶的核苷酸序列；优选地，所述多核苷酸包括选自以下组的核苷酸序列：(a)编码如SEQ ID NO:1或2或3所示蛋白的核苷酸序列；(b)SEQ ID NO:4或5或6所示的核苷酸序列；(c)SEQ ID NO:4或5或6所示的5
’
端和/或3
’
端截短的核苷酸序列或者添加核苷酸所形成的核苷酸序列；(d)与SEQ ID NO:4或5或6所示核苷酸序列具有同源性≥50％(例如≥70％、再例如≥90％)的核苷酸序列；(e)上述(a)-(d)任一核苷酸序列互补的核苷酸序列；优选地，所述(e)所述的核苷酸序列与(a)-(d)任一核苷酸序列完全互补。5.一种载体，含有权利要求4所...
【专利技术属性】
技术研发人员：江会锋，刘晓楠，程健，卢丽娜，
申请(专利权)人：中国科学院天津工业生物技术研究所，
类型：发明
国别省市：
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