一种乙醛脱氢酶基因DkALDH10及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种乙醛脱氢酶基因DkALDH10及其应用，其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。本发明专利技术通过对中国甜柿

【技术实现步骤摘要】
一种乙醛脱氢酶基因DkALDH10及其应用


[0001]本专利技术属于植物基因工程
，具体涉及一种乙醛脱氢酶基因DkALDH10及其应用。

技术介绍

[0002]我国是柿(Diospyros kaki Thunb.)原产地，也是世界上柿树栽培历史最悠久、面积最大和产量最多的国家，但传统产区以涩柿为主。柿果中存在特化的单宁细胞，其液胞中积累的原花青素(又称“单宁”，proanthocyanidin,PA)是食用后产生涩感的主要原因。根据果实成熟时能否在树上自然脱涩及其性状遗传特点，现有柿品种分为完全甜柿(Pollination
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constant&non
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astringent，PCNA；简称“甜柿”)和非完全甜柿(non
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PCNA；简称“涩柿”)。涩柿果实成熟后需经脱涩处理才能食用，不仅消耗人力、物力和财力，且脱涩后的果实货架期短；而脱涩不完全的柿果不仅商品性降低，还引起消费者对其诱发胃柿石(gastric phytobezoar)的恐惧。因此，成熟果实可在树上自然脱涩的完全甜柿是目前世界范围内产业发展和遗传改良的重点目标。
[0003]已有研究表明，中国甜柿自然脱涩是乙醛介导的可溶性单宁的不溶化过程，亦即果实中的挥发性产物乙醛与可溶性单宁结合转变生成不导致涩感的不溶性凝胶类物质(通称“凝固效应”)，该过程主要受乙醛代谢途径中的三个酶基因家族控制：丙酮酸脱羧酶(pyruvate decarboxylase,PDC)，乙醇脱氢酶(alcohol dehydrogenase,ADH)和醛脱氢酶(aldehyde dehydrogenases,ALDH)。其中，乙醛脱氢酶(ALDH)催化乙醛氧化形成乙酸、CO2和H2O。已有研究结果表明，利用乙醇和CO2等处理均显著增强ADH和PDC的活性，诱导果实乙醛含量升高，促进可溶性单宁向不溶性单宁的转化，最终导致果实脱涩。
[0004]柿遗传背景复杂，染色体倍性高，尤其是基因组信息和甜涩性状遗传规律的研究相对滞后。乙醛脱氢酶及其相关基因在木本植物中研究较少。此外，柿单宁单体的种类、胞质运输与跨膜转运的选择性，以及在液泡中的聚合方式等导致中国甜柿和日本甜柿具有不同的自然脱涩机理。其中，乙醛代谢的下游关键基因DkALDH在中国甜柿自然脱涩中的效应尚无直接相关证据，还鲜有DkALDH的基因功能被验证。

技术实现思路

[0005]本专利技术针对现有技术的空白点，根据中国甜柿
‘
鄂柿1号
’
果实发育的关键时期的果肉转录组数据进行表达差异筛选，克隆鉴定到了一个差异表达基因即乙醛脱氢酶基因DkALDH10，并首次验证其与中国甜柿自然脱涩之间的关系，完善了中国甜柿自然脱涩分子调控网络，为进一步的遗传改良调节柿脱涩提供了新的科学依据和基因资源。
[0006]本专利技术的目的之一在于提供一种乙醛脱氢酶DkALDH10，所述乙醛脱氢酶DkALDH10的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。
[0007]进一步的，所述乙醛脱氢酶DkALDH10定位于细胞质膜和液泡膜中。
[0008]本专利技术的目的之二在于提供了一种编码上述乙醛脱氢酶DkALDH10的基因，所述基
因为DkALDH10基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。
[0009]本专利技术的目的之三在于提供了一种编码上述DkALDH10基因的扩增引物，所述扩增引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：3
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4所示。
[0010]本专利技术的目的之四在于提供一种用于检测DkALDH10基因的荧光定量PCR特异引物，所述荧光定量PCR特异引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：5
‑
6所示。
[0011]本专利技术的目的之五在于提供一种包含上述DkALDH10基因的载体。
[0012]进一步的，所述载体为DkALDH10基因的超表达载体或干涉表达载体。
[0013]本专利技术的目的之六在于提供一种遗传工程菌，所述遗传工程菌中包含上述载体。
[0014]本专利技术的目的之七在于提供上述DkALDH10基因，或上述载体，或上述遗传工程菌在调节柿脱涩中的应用。
[0015]进一步的，所述DkALDH10基因，或载体，或遗传工程菌通过调节可溶性单宁和不溶性单宁的含量，调节柿脱涩。
[0016]与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：
[0017]本专利技术通过对中国甜柿
‘
鄂柿1号
’
果实发育期(花后10周和20周)的转录组数据进行表达差异筛选，首次获得并鉴定一个中国甜柿乙醛脱氢酶基因家族重要成员DkALDH10基因，并获得了DkALDH10基因的全长序列。本专利技术通过构建DkALDH10基因干涉载体和超表达载体，并测定不同载体转化后果实中可溶性单宁和不溶性单宁的含量，验证了DkALDH10基因是通过分解乙醛，抑制可溶性单宁向不溶性单宁的转化，进而影响了中国甜柿自然脱涩中的“凝固效应”，即DkALDH10基因通过调控乙醛代谢，调节柿果实中可溶性单宁和不溶性单宁的含量，进而调节柿脱涩过程。本专利技术首次阐明了DkALDH10基因与中国甜柿自然脱涩之间的关系，完善了甜柿自然脱涩分子调控网络，为调节柿脱涩提供了新的科学依据和基因资源。
附图说明
[0018]图1为本专利技术实施例1中三个柿品种的果实形态图和单宁含量变化图，其中图1
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A为中国甜柿
‘
鄂柿1号
’
，日本甜柿
‘
阳丰
’
，非完全甜柿
‘
磨盘柿
’
花后2.5
‑
27.5周的果实形态图，图1
‑
B为三种柿的可溶性单宁和不溶性单宁含量动态变化；
[0019]图2为本专利技术实施例2中差异表达基因DkALDH10基因在
‘
鄂柿1号
’
花后2.5
‑
27.5周的表达量变化趋势；
[0020]图3为本专利技术实施例2中不同物种的ALDH家族中的聚类分析结果；
[0021]图4为本专利技术实施例2中DkALDH10在烟草叶片中的亚细胞定位；
[0022]图5为本专利技术实施例3中柿果实圆片瞬时干涉表达DkALDH10后的结果，其中图5
‑
A为果实圆片的DMACA染色结果，图5
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B为可溶性单宁含量变化，图5
‑
C为不溶性单宁含量变化；
[0023]图6为本专利技术实施例3中利用
‘
恭城水柿
’
组培苗构建DkALDH10超表达株系或干涉表达株系后，不同株系中的可溶性单宁和不溶性单宁含量分析结果，其中图6
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A为DkALDH10超表达株系中可溶性单宁和不溶性单宁含量，图6
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B为DkALDH10干涉表达株系中可溶本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种乙醛脱氢酶DkALDH10，其特征在于，所述乙醛脱氢酶DkALDH10的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。2.根据权利要求1所述的一种乙醛脱氢酶DkALDH10，其特征在于，所述乙醛脱氢酶DkALDH10定位于细胞质膜和液泡膜中。3.一种编码权利要求1所述的乙醛脱氢酶DkALDH10的基因，其特征在于，所述基因为DkALDH10基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。4.一种用于扩增如权利要求3中所述的DkALDH10基因的扩增引物，其特征在于，所述扩增引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：3
‑
4所示。5.一种用于检测如权利要求3中所述的DkALDH10基因的荧光定量PCR特异引物，其特征在于，所述荧光定量PCR...

【专利技术属性】
技术研发人员：张青林，张萌，徐莉清，郭大勇，罗正荣，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：