野生氧化酶突变体及其制备方法和应用技术

本发明专利技术涉及医药化学领域，特别是涉及药物中间体的制备领域，更为具体的说是涉及野生氧化酶突变体及其制备方法和应用。所述野生氧化酶突变体为NADH依赖型氧化酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。利用本发明专利技术公开的野生氧化酶突变体能够高效氧化生成(4R

【技术实现步骤摘要】
野生氧化酶突变体及其制备方法和应用


[0001]本专利技术涉及医药化学领域，特别是涉及药物中间体的制备领域，更为具体的说是涉及野生氧化酶突变体及其制备方法和应用。

技术介绍

[0002]2‑
((4R,6S)
‑6‑
甲醛基
‑
2,2
‑
二甲基
‑
1,3二氧六环
‑4‑
基)
‑
乙酸甲酯是一种重要的药物中间体化合物。目前，合成2
‑
((4R,6S)
‑6‑
甲醛基
‑
2,2
‑
二甲基
‑
1,3二氧六环
‑4‑
基)
‑
乙酸甲酯常用的方法为化学合成法，主要包括两种：
[0003]方法一：
[0004][0005]该方法需要使用氧气氧化断裂双键，工艺操作复杂、制备成本高、有效转化率低，得到的产物纯度不高。同时，由于原料不易获得，其合成也较为复杂，增大了工业化成本。
[0006]方法二：
[0007][0008]该方法虽然简化了工艺，但是原料不易获得，其合成工艺同样比较复杂，不适合工业化生产。
[0009]酶法作为一种生物制备方法，具有副反应产物少、对环境友好、反应条件吻合、操作简单等优势。

技术实现思路

[0010]本专利技术所要解决的技术问题是，寻找一种生物制备方法，从而能够替代现有的化学合成方法制备得到药物中间体2
‑/>((4R,6S)
‑6‑
甲醛基
‑
2,2
‑
二甲基
‑
1,3二氧六环
‑4‑
基)
‑
乙酸甲酯。
[0011]为了解决上述技术问题，本专利技术公开了野生氧化酶突变体，所述野生氧化酶突变体为NADH依赖型氧化酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
[0012]同时本专利技术还公开了编码所述野生氧化酶突变体的核酸分子，该核酸分子的碱基序列如SEQ ID：2所示。
[0013]进一步的本专利技术还公开了含有上述野生氧化酶突变体的核酸分子的载体。
[0014]优选的，在本专利技术中所述载体为pET
‑
30a质粒载体。
[0015]同时，在本专利技术中还进一步公开了含有上述的载体的重组菌，优选的，所述重组菌为面包酵母、酿酒酵母、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌中的任意一种，优选为大肠杆菌，更为优选的是大肠埃希氏菌(E.coli)BL21(DE3)。
[0016]同时，在本专利技术中还进一步公开了前述野生氧化酶突变体的制备方法，该方法以异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导前述重组菌，从而得到本专利技术所说的野生氧化酶突变体。
[0017]在一个优选的技术方案中，本专利技术进一步优选当重组菌培养液的OD600达到0.6时，加入终浓度为0.1mmol/L的丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导获得野生氧化酶突变体。
[0018]最后，本专利技术还公开了所述的野生氧化酶突变体在式II氧化制备式I中的应用，其反应方程式如下：
[0019][0020]其中氧化酶的形式可以是细胞裂解液中的混合物酶、和/或经提取的粗酶、和/或经过处理的固定化酶。
[0021]作为优选，所述氧化反应中使用NAD+作辅因子。
[0022]进一步优选的，所述氧化反应中还添加有NADH氧化酶(NOX)，从而能够实现辅酶因子的再生。
[0023]作为一种优选，在本专利技术中还进一步公开了任意选择以下任意一个或者多个优选的反应条件：
[0024]a.所述的氧化酶的用量在1～10U/ml；
[0025]b.所述NADH氧化酶的用量在0.5～8U/ml；
[0026]c.所述NAD+用量在0.1～1.0mmol/L；
[0027]d.反应温度为0℃～80℃，优选为10～50℃，更为优选的是15～37℃；
[0028]e.反应环境的pH值为4～12，优选为pH 4～8，更优选为5～8；
[0029]f.式Ⅱ所示化合物的浓度为20～200mmol/L；
[0030]g.还添加有缓冲液Tris
‑
HCl，缓冲液的浓度为0.1～0.2mol/L。
[0031]利用本专利技术公开的野生氧化酶突变体能够高效氧化生成(4R
‑
cis)
‑6‑
甲醛基
‑
2,2二甲基
‑
1,3
‑
二氧六环
‑4‑
乙酸叔丁酯。不仅反应条件温和，而且在辅酶系统参与下可以达到无副产物产生的效果，对环境友好。通过本专利技术公开的方法制备(4R
‑
cis)
‑6‑
甲醛基
‑
2,2二甲基
‑
1,3
‑
二氧六环
‑4‑
乙酸叔丁酯底物转化率可达92％，所生成的(4R
‑
cis)
‑6‑
甲醛基
‑
2,2二甲基
‑
1,3
‑
二氧六环
‑4‑
乙酸叔丁酯产物纯度可达93％，是一种经济、高效的制备方
法。
具体实施方式
[0032]为了更好的理解本专利技术，下面我们结合具体的实施例对本专利技术进行进一步的阐述。
[0033]除非有特殊说明，在本专利技术实施例中所用试剂均为普通市售产品。
[0034]实施例1构建工程菌
[0035]1.1易错PCR设计
[0036]以野生氧化酶(NCBI登录号XM_005867960.2)的原始DNA序列为模板密码子优化后进行人工设计，设计后核酸序列如SEQ ID：2所示，其编码得到的氨基酸序列如SEQ ID：1所示。
[0037]1.2 PCR突变扩增
[0038]PCR扩增体系为：10
×
PCR buffer 10μL，d NTP(0.1M)2.4μL，d NTP 2.5mM 1μL，MgCl
2 5mM 20μL，MgCl
2 0.2mmol/L 20μL，F Primer1μL，R Primer 1μL,pUC18模板1pUC18，Taq酶2U，ddH2O补齐至100μL。
[0039]PCR扩增程序为：95℃预变性5min；94℃变性45s，55℃变性45s，72℃延伸45s进行30个循环；72℃继续延伸10min，4℃保存。
[0040]1.3工程菌制备
[0041]选择BamH I和XhoI酶酶切位点将上述PCR扩增产物导入质粒pET
‑
30a中，引物序列为：
[0042]F：gcgggatccatgttgctcaagcaaataaaatatctgt，
[0043]R：ccgctcgagt本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.野生氧化酶突变体，其特征在于：所述野生氧化酶突变体为NADH依赖型氧化酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。2.编码权利要求1所述野生氧化酶突变体的核酸分子，其特征在于：所述核酸分子的碱基序列如SEQ ID：2所示。3.含有编码权利要求1所述野生氧化酶突变体的核酸分子的载体；进一步优选的，所述载体为pET
‑
30a质粒载体。4.含有权利要求3所述的载体的重组菌，进一步优选的，所述重组菌为面包酵母、酿酒酵母、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌中的任意一种，优选为大肠杆菌，更为优选的是大肠埃希氏菌(E.coli)BL21(DE3)。5.一种制备权利要求1中所述野生氧化酶突变体的方法，其特征在于：以异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导权利要求3中所述的重组菌，得到权利要求1中所述的野生氧化酶突变体。6.根据权利要求5所述的野生氧化酶突变体的方法，其特征在于：当重组菌培养液的OD600达到0.6时，加入终浓度为0.1mmol/L的丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导获得野生氧化...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈本顺，李大伟，何伟，石利平，徐春涛，钱若灿，叶金星，张维冰，万新强，尹斌，徐秋斌，
申请(专利权)人：江苏阿尔法药业有限公司，
类型：发明
国别省市：