催化活性提高的黄酮3β-羟化酶突变体及其应用制造技术

本发明专利技术公开了催化活性提高的黄酮3β

【技术实现步骤摘要】
催化活性提高的黄酮3
β-羟化酶突变体及其应用


[0001]本专利技术涉及催化活性提高的黄酮3β-羟化酶突变体及其应用，属于基因工程


技术介绍

[0002]圣草酚(Eriodictyol)是一种重要的黄酮类化合物，对人体具有多种益处，如抗炎、抗衰老、抗氧化等作用，广泛应用于食品添加剂。同时也是多种高附加值化合物的前体，如黄杉素、花青素、水飞蓟及大风子素等。圣草酚主要来自于植物提取法，然而植物提取法有许多缺点，如需要高温、提取时间长、需要大量有机试剂等。而使用微生物法生产黄酮类化合物具有较高的潜力。
[0003]柚皮素(Naringenin)经过F3
′
H催化，可以在柚皮素3
′
引入羟基，从而获得圣草酚。由于F3
′
H属于P450酶(Cytochrome P450)，因此需要辅酶CPR辅助获得电子才具有催化功能，因此F3
′
H需要与CPR共表达才具有较好的催化功能。但是只有较少的F3
′
H及其辅酶CPR的催化功能被很好的验证，此外，由于F3
′
H/CPR需要锚定在内质网上才可以高效传递电子(图1)，因此大部分的F3
′
H/CPR在原核微生物中表达活性很低甚至没有活性。由于缺乏高效的F3
′
H/CPR，对F3
′
H/CPR表达模式的研究也较少，无法进一步对F3
′
H/CPR的表达强度进一步提高，目前已报道的使用F3r/>′
H催化柚皮素获得圣草酚的最高产量仅200mg/L(Amor,I.L.,et al.,Biotransformation of naringenin to eriodictyol by Saccharomyces cerevisiea functionally expressing flavonoid3'hydroxylase.Nat Prod Commun,2010.5(12):p.1893
–
1898.)。在大肠杆菌中合成圣草酚的产量最高仅107mg/L(Zhu,S.,et al.,Efficient synthesis of eriodictyol from L-tyrosine in Escherichia coli.Appl Environ Microbiol,2014.80(10):p.3072
–
3080.)。
[0004]目前利用微生物法生产圣草酚的转化效率和产量都很低，限制了其在实际生产中的应用。

技术实现思路

[0005]本专利技术中出发基因为来源于水飞蓟的黄酮3β-羟化酶SmF3
′
H，因为SmF3
′
H的结构未知，通过理性改造进一步提高SmF3
′
H的酶活比较困难，为进一步提高圣草酚的合成，可以利用定向进化技术获得酶活提高的SmF3
′
H突变子，以及相应的高产圣草酚菌株，这对实现工业化微生物法生产圣草酚具有十分重要的意义。
[0006]本专利技术的第一个目的是提供黄酮3β-羟化酶突变体，所述突变体以氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的黄酮3β-羟化酶为亲本，分别将亲本第344位，或第285位的氨基酸进行突变。
[0007]在本专利技术的一种实施方式中，亲本的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示。
[0008]在本专利技术的一种实施方式中，将亲本第344位氨基酸突变为丝氨酸，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
[0009]在本专利技术的一种实施方式中，将亲本第285位氨基酸突变为天冬酰胺，氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
[0010]本专利技术的第二个目的是提供编码所述突变体的基因，所述突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.2或如SEQ ID NO.3所示。
[0011]在本专利技术的一种实施方式中，编码氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示黄酮3β-羟化酶突变体的编码基因序列如SEQ ID NO.4所示。
[0012]在本专利技术的一种实施方式中，编码氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示的黄酮3β-羟化酶突变体的编码基因序列如SEQ ID NO.5所示。
[0013]本专利技术的第三个目的是提供携带编码所述突变体的基因的载体。
[0014]在本专利技术的一种实施方式中，所述载体为pY26-TEF-GPD。
[0015]本专利技术的第四个目的是提供表达所述突变体，或含有所述基因的微生物细胞。
[0016]在本专利技术的一种实施方式中，所述微生物细胞为原核细胞或真核细胞。
[0017]在本专利技术的一种实施方式中，所述微生物细胞为酿酒酵母。
[0018]在本专利技术的一种实施方式中，所述微生物细胞还表达黄酮3β-羟化酶辅酶，所述黄酮3β-羟化酶辅酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。
[0019]本专利技术的第五个目的是提供一种全细胞转化生产圣草酚的方法，将所述微生物细胞加入以柚皮素为底物的反应体系中。
[0020]在本专利技术的一种实施方式中，将所述微生物细胞在25-32℃，200-250rpm培养16-18h，获得种子培养基，将种子培养基以1-5mL/100mL的量加入反应体系中。
[0021]本专利技术的第六个目的是提供一种生产圣草酚的方法，将所述突变体加入含有柚皮素的反应体系中，与黄酮3β-羟化酶的辅酶共同作用，转化生产圣草酚。
[0022]本专利技术的第七个目的是提供所述突变体，或所述载体，或所述微生物细胞在生产圣草酚或以圣草酚为原料的产品中的应用。
[0023]有益效果：本专利技术通过对水飞蓟来源的黄酮3β-羟化酶进行突变，通过高通量的筛选方法，筛选到了能够使得圣草酚产量提高的黄酮3β-羟化酶突变体。在酿酒酵母中表达SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3所示的编码黄酮3β-羟化酶突变体的基因，使黄酮3β-羟化酶催化柚皮素产圣草酚的能力提高，圣草酚产量由805.6mg/L分别提高至1017.8mg/L和1046.5mg/L，圣草酚的产量分别增加了26.3％和29.9％。通过将最佳突变体进行组合，在发酵罐水平首次获得了克级别的圣草酚积累，达到3.28g/L，是已报道最高产量的16.4倍。
附图说明
[0024]图1为通过随机突变对SmF3
′
H进行定向进化的示意图。
[0025]图2为定向进化获得的高产菌株及其圣草酚产量图。
[0026]图3为在5L发酵罐上进行发酵优化时圣草酚的产量变化图。
[0027]图4为高通量筛选示例。
具体实施方式
[0028](1)YNB培养基：0.72g/L酵母氮源基础培养基、20g/L葡萄糖、50mg/L亮氨酸、50mg/L色氨酸、50mg/L组氨酸。
[0029](2)YPD培养基：10g/L酵母粉、20g/L蛋白胨、20g/L葡萄糖。
[0本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.黄酮3β-羟化酶突变体，其特征在于，所述突变体以氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的黄酮3β-羟化酶为亲本，分别将亲本第344位，或第285位突变。2.根据权利要求1所述的突变体，其特征在于，将亲本第344位的精氨酸突变为丝氨酸，或将将第285位的天冬氨酸突变为天冬酰胺。3.编码权利要求1或2所述突变体的基因。4.携带权利要求3所述基因的载体。5.表达权利要求1或2所述突变体，或含有权利要求3所述基因的微生物细胞。6.根据权利要求5所述的微生物细胞，其特征在于，所述微生物细胞还表达黄酮3β-羟化酶辅酶。7.一种全细胞转化生产圣草...

【专利技术属性】
技术研发人员：周景文，陈坚，高松，曾伟主，堵国成，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：