细胞色素P450酶突变体及其应用制造技术

本发明专利技术提供了一种细胞色素P450酶突变体及其应用。通过定向进化的手段对来源于Bacillus megaterium野生型菌株的P450酶活和反马尔科夫氧化的选择性进行蛋白质改造，提高了酶的活性和选择性，开发出了一系列可用于工业化生产的P450酶突变体。业化生产的P450酶突变体。

【技术实现步骤摘要】
细胞色素P450酶突变体及其应用


[0001]本专利技术涉及酶
，具体而言，涉及一种细胞色素P450酶突变体及其应用。

技术介绍

[0002]催化烯烃类原料的反马尔科夫氧化反应可以简化很多重要化工原料的合成路线。对烯烃类化合物进行直接的反马尔科夫氧化反应生成相应的羰基化合物是有机合成中十分重要的挑战，这个过程中往往需要高效的催化剂参与。目前的合成方法中，使用贵金属作为催化剂存在转化效率和对映选择性低，需要多步催化，三废多等问题 [G. Dong, P. Teo, Z. K. Wickens, R. H. Grubbs, Primary alcohols from terminal olefins: Formal anti-Markovnikov hydration via triple relay catalysis. Science 333, 1609
–
1612(2011)]。
[0003]细胞色素P450单加氧酶（P450s）是一类亚铁血红素依赖的酶家族，以氧气作为氧化剂，能够在温和的条件下选择性地活化C-H键，催化多种传统化学方法难以实现的合成反应，包括烯烃的氧化反应，在精细化学和药物及其代谢物合成方面具有极大的应用潜力。来源于Bacillus megaterium的P450（BM3）属于自给自足型的单加氧酶，即参与电子传递的氧化还原蛋白伴侶与P450氧化酶部分融合在一条肽链上。这种融合重组的结构大大提高了电子传递效率和氧化反应的电子耦合效率，BM3也是目前催化效率较高的P450酶之一。
[0004]但目前尚无高效催化烯烃类化合物进行反马尔科夫氧化反应的BM3酶的报道。

技术实现思路

[0005]本专利技术的主要目的在于提供一种细胞色素P450酶突变体及其应用，以解决现有技术中尚无高效催化烯烃类化合物进行反马尔科夫氧化反应的P450酶。
[0006]为了实现上述目的，根据本专利技术的一个方面，提供了一种细胞色素P450酶突变体，该突变体包括：(a) 在SEQ ID NO：1的序列上发生一个或多个氨基酸突变的蛋白，且蛋白具有细胞色素P450酶的反马尔科夫氧化活性；或者(b) 来源于Bacillus megaterium菌株，且与SEQ ID NO：1具有80%以上同源性的氨基酸序列，且具有细胞色素P450酶的反马尔科夫氧化活性。
[0007]进一步地，突变体为在SEQ ID NO：1的序列上发生1~14个中任意一个或多个，优选2~14个，更优选3~14个，进一步优选10~14个氨基酸突变的蛋白，且蛋白具有细胞色素P450酶的反马尔科夫氧化活性。
[0008]进一步地，突变体为来源于Bacillus megaterium菌株，且与SEQ ID NO：1具有85%以上，优选为90%以上，更优选为95%以上，进一步优选为99%以上同源性，且具有细胞色素P450酶的反马尔科夫氧化活性；进一步优选突变体在SEQ ID NO：1基础上发生1~14个中任意一个或多个，优选2~14个，更优选3~14个，进一步优选10~14个氨基酸突变。
[0009]进一步地，突变体是在SEQ ID NO：1基础上发生下氨基酸突变：
。
[0010]为了实现上述目的，根据本专利技术的一个方面，提供了一种DNA分子，编码上述任一种突变体。
[0011]为了实现上述目的，根据本专利技术的一个方面，提供了一种重组质粒，该重组质粒连接有上述的DNA分子。
[0012]进一步地，重组质粒选自如下任意一种：pET-21b（+）、pET-22b（+）、pET-3a（+）、pET-3d（+）、pET-11a（+）、pET-12a（+）、pET-14b（+）、pET-15b（+）、pET-16b（+）、pET-17b（+）、pET-19b（+）、pET-20b（+）、pET-21a（+）、pET-23a（+）、pET-23b（+）、pET-24a（+）、pET-25b（+）、pET-26b（+）、pET-27b（+）、pET-28a（+）、pET-29a（+）、pET-30a（+）、pET-31b（+）、pET-32a（+）、pET-35b（+）、pET-38b（+）、pET-39b（+）、pET-40b（+）、pET-41a（+）、pET-41b（+）、pET-42a（+）、
pET-43a（+）、pET-43b（+）、pET-44a（+）、pET-49b（+）、pQE2、pQE9、pQE30、pQE31、pQE32、pQE40、pQE70、pQE80、pRSET-A、pRSET-B、pRSET-C、pGEX-5X-1、pGEX-6p-1、pGEX-6p-2、pBV220、pBV221、pBV222、pTrc99A、pTwin1、pEZZ18、pKK232-18、pUC-18以及pUC-19。
[0013]为了实现上述目的，根据本专利技术的一个方面，提供了一种宿主细胞，该宿主细胞含有上述任一种重组质粒。
[0014]进一步地，宿主细胞为原核细胞或真核细胞，优选真核细胞为酵母细胞。
[0015]进一步地，宿主细胞为感受态细胞，优选感受态细胞为大肠杆菌BL21细胞或大肠杆菌W3110。
[0016]为了实现上述目的，根据本专利技术的一个方面，提供了一种羰基化合物或醇类化合物的制备方法，该制备方法包括：采用上述任一种细胞色素P450酶突变体催化烯烃类化合物进行直接的反马尔科夫氧化反应生成羰基化合物和醇类化合物，其中，R表示任选取代或未被取代的烷基、任选取代或未被取代的芳烷基、或任选取代或未被取代的芳基。
[0017]进一步地，R表示碳原子数为1-20的任选取代或未被取代的烷基、任选取代或未被取代的芳烷基、或任选取代或未被取代的芳基；优选的，R表示碳原子数为1-10的任选取代或未被取代的烷基、任选取代或未被取代的芳烷基、或任选取代或未被取代的芳基；优选的，取代是指被卤素原子、氮原子、硫原子、羟基、硝基、氰基、甲氧基、乙氧基、羧基、羧甲基、羧乙基或亚甲二氧基取代；优选的，烯烃类化合物为苯环上任意位置被取代或未被取代的苯乙烯类化合物，反应为生成或的反马尔科夫氧化反应，其中，R1表示苯环上任意位置取代为卤素、硝基、甲基或甲氧基；优选的，卤素取代为氯原子取代；更优选地，烯烃类化合物为如下任一种：、、及。
[0018]应用本专利技术的技术方案，通过定向进化的手段对野生酶进行蛋白质改造，提高了酶的活性和选择性，开发出可用于工业化生产的P450酶。
具体实施方式
[0019]需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将结合实施例来详细说明本专利技术。
[0020]由于目前尚无高效催化烯烃类化合物进行反马尔科夫氧化反应的BM3酶的报道，为改善这一状况，本申请的专利技术人通过酶筛选发现BM3具有催化烯烃类化合物进行反马尔科夫氧化反应的活力，但是其活性较低，反马尔科夫氧化的选择性较差。为了进一步提高其催化反应活性和/或其选本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种细胞色素P450酶突变体，其特征在于，所述突变体在SEQ ID NO：1基础上发生如下氨基酸突变：
。2.一种DNA分子，其特征在于，编码权利要求1所述的突变体。3.一种重组质粒，其特征在于，所述重组质粒连接有权利要求2所述的DNA分子。4.根据权利要求3所述的重组质粒，其特征在于，所述重组质粒选自如下任意一种：pET-21b（+）、pET-22b（+）、pET-3a（+）、pET-3d（+）、pET-11a（+）、pET-12a（+）、pET-14b（+）、pET-15b（+）、pET-16b（+）、pET-17b（+）、pET-19b（+）、pET-20b（+）、pET-21a（+）、pET-23a（+）、pET-23b（+）、pET-24a（+）、pET-25b（+）、pET-26b（+）、pET-27b（+）、pET-28a（+）、pET-29a（+）、pET-30a（+）、pET-31b（+）、pET-32a（+）、pET-35b（+）、pET-38b（+）、pET-39b（+）、pET-40b（+）、pET-41a（+）、pET-41b（+）、pET-42a（+）、pET-43a（+）、pET-43b（+）、pET-44a（+）、pET-49b（+）、pQE2、pQE9、pQE30、pQE31、pQE32、pQE40、pQE70、pQE80、pRSET-A、pRSET-B、pRSET-C、pGEX-5X-1、pGEX-6p-1、pGEX-6p-2、pBV220、pBV221、pBV222、pTrc99A、pTwin1、pEZZ18、pKK232-18、pUC-18以及pUC-19。5.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主...

【专利技术属性】
技术研发人员：洪浩，詹姆斯，
申请(专利权)人：凯莱英生命科学技术天津有限公司，
类型：发明
国别省市：