一种甾体5β还原酶变体及其用途制造技术

本发明专利技术涉及一种甾体5β还原酶变体及其用途。所述甾体5β还原酶变体具有甾体5β还原酶活性，其氨基酸序列包含R63K和R64H突变，能够利用NADH为辅酶，且具有选自以下的氨基酸序列：1)SEQ ID NO:1、3或5所示氨基酸序列；2)SEQ ID NO:1、3或5所示氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或多个氨基酸而得到的氨基酸序列；或3)与SEQ ID NO:1、3或5具有69％以上序列同一性的氨基酸序列。所述甾体5β还原酶变体的转化产物构象单一，只有β型还原产物出现，具有空间加氢特异性，产物中无α型结构，具有高效、稳定的特点。稳定的特点。

【技术实现步骤摘要】
一种甾体5
β
还原酶变体及其用途


[0001]本专利技术涉及基因工程和酶工程领域，更具体而言，本专利技术涉及一种甾体5β还原酶变体及其用途。

技术介绍

[0002]甾体药物是广泛应用于临床的一大类药物，其大致分为类皮质激素和性激素两大类，对机体起着非常重要的调节作用，在医药工业中占有重要的地位。甾体药物的发现及成功合成是近半个世纪以来医药工业取得的最引人注目的两大进展之一。然而，利用化学法合成时，往往合成步骤多，效率低，价格昂贵。1950年Murray和Peterson利用黑根霉高效转化黄体酮为11α-羟基黄体酮，使从孕酮合成皮质酮只需要3步，这一研究成果引起了微生物学者的极大兴趣，此后开展了大量的微生物对甾体转化的研究工作。
[0003]有别于甾体化合物结构中的5α氢，胆酸类化合物5位上的氢为5β，是一个重要的化学结构，其化学合成难度大，急需高效专一的生物转化法。文献报道，所有甾体5β还原酶均以NADPH为辅酶(Herl V,Fischer G,Reva VA,Stiebritz M,Muller YA,M
ü
ller-Uri F,Kreis W:The VEP1 gene(At4g24220)encodes a short-chain dehydrogenase/reductase with3-oxo-Delta4,5-steroid 5beta-reductase activity in Arabidopsis thaliana L.Biochimie 2009,91(4):517-525.)，但是在实际工业生产中由于NADPH稳定性差，价格昂贵，不能工业化应用。
[0004]由于自然存在的酶在工业生产上会存在很多问题，例如对底物催化缓慢，稳定性差，或生产成本高等，不适用于工业应用。而对于甾体5β还原酶类，考虑最多的是酶对底物的催化速度和辅酶的选择性。因此，需要深入了解甾体5β还原酶的辅酶特异性问题。若甾体5β还原酶能够以NADH为辅酶，则将可以克服这些困难，因此甾体5β还原酶利用的辅酶由NADPH转变为NADH的研究具有重大应用价值。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的在于克服现有技术中存在的缺陷与不足，提供了一种甾体5β还原酶的变体，该变体的辅酶特异性由稳定性差的NADPH改变为价格低廉、性质稳定的NADH，该变体具有高效、稳定的特点，能够大大降低实际工业生产的成本。
[0006]不受具体理论约束，本专利技术提供的甾体5β还原酶变体将甾体转化为5β-甾体的方程式如下：
[0007][0008]其中，R可为任何取代基，如羟丙基或乙酰基。
[0009]本专利技术通过对甾体5β还原酶进行改造，获得了一种甾体5β还原酶变体，所述甾体5β还原酶变体的氨基酸序列包括两个相邻位点的RR突变为相邻的KH。优选地，该变体的SEQ ID NO:1、3或5所示氨基酸序列具有R63K和R64H突变(R63K/R64H)。该突变使得甾体5β还原酶可利用NADPH和NADH为辅酶。
[0010]本专利技术提供了一种具有甾体5β还原酶活性的甾体5β还原酶变体，所述甾体5β还原酶变体的氨基酸序列包含R63K和R64H突变，能够利用NADH为辅酶，且具有选自以下的氨基酸序列：
[0011]1)SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:5所示氨基酸序列；
[0012]2)SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:5所示氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或多个氨基酸而得到的氨基酸序列；或
[0013]3)与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:5具有69％以上序列同一性的氨基酸序列。
[0014]优选地，所述甾体5β还原酶变体能够利用NADPH和NADH为辅酶。
[0015]优选地，所述甾体5β还原酶变体是CmP5βR-LY，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，其编码多核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。具体序列如下：
[0016]SEQ ID NO:1
[0017]MSWWGAGAIGAAKKKLDDDEPTQSYESVALIIGVTGIVGNSLAEILPLSDTLGGPWKVYGVAKHPRPSWNADHPIDYIQCDVSNADDARSKLSPLTDVTHVFYVTWTNRESETENCEANGSMLRNVLRAVVPHAPNLRHVCLQTGTKHYLGPFTNVDGPHHDPPFTEDMPRLQIQNFYYTQEDVLFEEIKKKEGVTWSIHRPNMIFGFSPYSLMNIVGTLCVYAAICKHEGSPLMFPGSKKAWEGFMTASDADLIAEQQIWAAVDPYAKNEAFNCNNADIFKWKHLWKILAEQFGIEEYGFEEGKNLGLVEMMKGKERVWEEMVKENQLLEKKLDEVGVWWFADVILGVEGMIDSMNKSKEHGFLGFRNSNNSFISWIDKYKAFKIVP
[0018]SEQ ID NO:2
[0019]ATGAGCTGGTGGGGCGCCGGTGCGATTGGTGCGGCGAAAAAGAAACTGGACGATGACGAGCCGACCCAGAGCTACGAGAGTGTTGCGCTGATCATCGGCGTTACGGGCATCGTTGGCAACAGTCTGGCGGAAATTCTGCCACTGAGCGATACGCTGGGTGGCCCGTGGAAAGTGTATGGTGTTGCGAAACATCCACGTCCAAGCTGGAATGCCGACCACCCGATCGACTACATCCAGTGCGACGTGAGTAACGCCGATGATGCGCGCAGCAAACTGAGCCCGCTGACCGATGTTACCCACGTGTTTTACGTGACGTGGACCAACCGCGAAAGCGAAACGGAAAACTGCGAAGCGAACGGCAGCATGCTGCGCAATGTGCTGCGCGCCGTTGTGCCACATGCCCCAAATCTGCGCCATGTGTGTCTGCAGACCGGCACGAAACACTATCTGGGCCCGTTTACGAATGTGGATGGCCCACACCACGACCCACCGTTCACGGAAGATATGCCGCGCCTCCAGATCCAGAACTTCTACTACACCCAAGAAGATGTGCTCTTTGAGGAGATCAAGAAAAAAGAAGGCGTGACGTGGAGCATCCACCGCCCAAATATGATCTTCGGCTTCAGCCCGTACAGTCTGATGAATATCGTGGGCACGCTGTGTGTGTACGCCGCCATCTGCAAACATGAGGGTAGTCCGCTGATGTTCCCGGGCAGTAAAAAAGCGTGGGAGGGCTTCATGACCGCCAGCGATGCCGACCTCATCGCCGAACAGCAGATTTGGGCGGCCGTGG本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种具有甾体5β还原酶活性的甾体5β还原酶变体，所述甾体5β还原酶变体的氨基酸序列包括两个相邻位点的RR突变为相邻的KH。2.根据权利要求1所述的甾体5β还原酶变体，其中所述甾体5β还原酶变体包含R63K和R64H突变，能够利用NADH为辅酶，且具有选自以下的氨基酸序列：1)SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:5所示氨基酸序列；2)SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:5所示氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或多个氨基酸而得到的氨基酸序列；或3)与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:5具有69％以上序列同一性的氨基酸序列；优选地，所述甾体5β还原酶变体能够利用NADPH和NADH为辅酶。3.根据权利要求1或2所述的甾体5β还原酶变体，其中所述甾体5β还原酶变体催化底物所获得的产物5位的氢构象为β型。4.根据权利要求1-3中任一项所述的甾体5β还原酶变体，其中所述甾体5β还原酶变体的氨基酸序列如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:5所示。5.一种分离的多核苷酸，其编码权利要求1-4中任一项所述的甾体5β还原酶变体；优选地，所述多核苷酸序列如SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:6所示。6.一种表达载体，其包含权利要求5所述的多核苷酸；优选地，所述表达载体为真核或原核生物的染色体；优选地，所述表达载体选自真核表达载体或原核表达载体；优选地，所述表达载体为质粒，优选为pcDNA3.1或pET26b(+)。7.一种宿主...

【专利技术属性】
技术研发人员：齐福平，李园园，
申请(专利权)人：沈阳博泰生物制药有限公司，
类型：发明
国别省市：