本发明专利技术公开了一种重组细胞色素P450酶，重组细胞色素P450酶所编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明专利技术还同时提供了由上述重组细胞色素P450的编码基因构建的重组载体，为质粒pET28b(+)
【技术实现步骤摘要】
重组细胞色素P450酶及其应用
[0001]本专利技术涉及从二氯甲烷降解菌Microbacterium keratanolyticum ZY中基因克隆并异源表达细胞色素P450，纯化该酶以及对该酶特性的研究。
技术介绍
[0002]二氯甲烷(DCM)作为一种有机溶剂，广泛应用于金属制备、医药合成、涂料等化工行业。近年来，在生产和使用过程中，大量的二氯甲烷通过气体扩散进入环境。DCM半衰期长，会在环境中长期积累，对人和动物有毒性和致癌致突变作用，严重破坏臭氧层。二氯甲烷是一种剧毒的卤代烃，被美国环保署列为重点污染物。
[0003]因此，人们通过物理、化学和生物方法对二氯甲烷的降解进行了大量的研究。生物方法被认为是最有效和最清洁的方法，特别是一些细菌被发现能有效降解。如Chen曾报道，从活性污泥中分离出的Methylobacterium rhodesianum H13在25小时内可降解5mM DCM。Yu曾报道，Bacillus circulans WZ-12在48小时内对DCM具有良好的降解效果，其降解率与浓度有关。当DCM浓度为16mM时，36h内降解率可达90％，可有效处理高盐氯化烃工业废水。这些菌株都是由二氯甲烷脱卤酶介导所降解的。二氯甲烷脱卤酶与底物亲和力较低，且单独分离出来的时候降解效果低，酶对温度、pH的适应性较低。生物降解二氯甲烷主要有三个途径，上述的二氯甲烷脱卤酶介导的降解途径被很多人报道过，同时细菌可通过卤代烷烃脱卤酶对DCM进行水解脱卤，一些卤代烷烃脱卤酶可作用底物种类广泛，因而对DCM也有很好的适应性。第三个途径，也可通过一些细菌的单加氧酶或者细胞色素P450起到降解作用，之前这个途径主要在小鼠和肝细胞中被发现。
[0004]专利技术人发现微杆菌属是一个系统发育和生理多样性属，其成员广泛存在于受多环芳香烃(PAH)等有机物和重金属污染的污泥中。专利技术人从污泥中分离出了一株能降解二氯甲烷的细菌Microbacterium keratanolyticum ZY，该菌能有效降解二氯甲烷。
技术实现思路
[0005]本专利技术要解决的问题是提供一种从二氯甲烷降解菌Microbacterium keratanolyticum ZY中基因克隆并异源表达细胞色素P450及其用途。
[0006]即，专利技术为了克服原有的二氯甲烷降解菌降解菌株单一，且纯酶降解效果低，酶作用范围具有局限性等问题，提供了Microbacterium keratanolyticum ZY中细胞色素P450的编码基因和提供了一种能降解二氯甲烷的酶，细胞色素P450。
[0007]为解决上述技术问题，本专利技术提供一种重组细胞色素P450酶，重组细胞色素P450酶所编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
[0008]即，本专利技术提供一种所述的重组细胞色素P450的编码基因，编码基因核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示。
[0009]本专利技术还同时提供了由上述重组细胞色素P450的编码基因构建的重组载体，为质粒pET28b(+)-细胞色素P450。
[0010]本专利技术还同时提供了由上述重组载体转化制备的重组基因工程菌，为重组大肠杆菌BL21(DE3)-pET28b(+)-细胞色素P450。
[0011]本专利技术还同时提供了上述重组基因工程菌的制备方法，依次进行如下步骤：
[0012](1)将重组细胞色素P450的编码基因克隆至外源基因表达质粒上，获得重组质粒；
[0013](2)将重组质粒转入大肠杆菌感受态细胞，接种至LB液体培养基，20～37℃、50～250r/min振荡培养0.5～2h，获得转化产物；
[0014](3)将转化产物涂布于含50μg/mL卡那霉素的平板，20～37℃培养，筛选获得含重组细胞色素P450编码基因的工程菌。
[0015]说明：平板上所得转化子经菌落PCR验证，发现约在1200bp处有明显条带，测序后发现与细胞色素P450的序列(SEQ ID NO.1)一致，然后进行保存，即为含重组细胞色素P450编码基因的工程菌。
[0016]作为本专利技术的重组基因工程菌的制备方法的改进：外源基因表达质粒为下列之一：
①
pET系列，
②
pUC系列，
③
pGEM系列，
④
pBluescript系列。优选pET28b(+)。
[0017]本专利技术还同时提供了上述重组细胞色素P450的用途：降解二氯甲烷、1,2-二氯乙烷，具有特异性。
[0018]作为本专利技术的重组细胞色素P450的用途的改进：所述重组细胞色素P450在降解底物上具有广谱性(能降解二氯甲烷、1,2-二氯乙烷)。
[0019]作为本专利技术的重组细胞色素P450的用途的进一步改进：将含重组细胞色素P450编码基因的工程菌(即重组大肠杆菌BL21(DE3)-pET28b(+)-细胞色素P450)经发酵培养，得发酵液；
[0020]将发酵液中提取的重组细胞色素P450与PBS缓冲液混合，加入底物二氯甲烷(DCM)、辅酶(NADH)构成反应体系，在25～45℃(优选35℃)反应完全(2h)，所述反应体系中，缓冲液pH为5～10(优选8)；所述反应体系中，辅酶浓度为0.1～0.5g/L(优选0.5g/L)。
[0021]说明：每半小时取反应液进行离子色谱检测以获得二氯甲烷的脱氯率。
[0022]作为本专利技术的重组细胞色素P450的用途的进一步改进：将含重组细胞色素P450编码基因的工程菌经发酵培养获得的发酵液提取的重组细胞色素P450与pH 8的PBS缓冲液混合，加入10mg/L的底物、辅酶(NADH)构成反应体系，在35℃水浴中反应；所述底物为：1,2-二氯乙烷、苯、甲苯、氯苯。
[0023]说明：每半小时取反应液进行离子色谱检测以获得脱氯率。
[0024]作为本专利技术的重组细胞色素P450的用途的进一步改进：所述重组细胞色素P450按如下方法制备：
[0025](1)将含重组细胞色素P450编码基因的工程菌接种至LB固体培养基，在20～37℃(优选37℃)下活化后接入LB液体培养基，在20～37℃、50～250r/min培养8～48h(优选37℃、200rpm、12h)后，以体积浓度0.1％～20％(优选2％)接种量转入发酵培养基，20～37℃、50～250r/min培养至OD600达到0.4-1.0后(优选37℃、200rpm、OD600为0.6)，加入诱导剂IPTG，IPTG终浓度0.01～1.51mM(优选0.2mM)，在20～37℃、50～250r/min培养4～48h(优选30℃、200rpm、6h)后，获得发酵液；
[0026](2)将发酵液离心取菌体，用PBS缓冲液(pH为7)洗涤之后，加入15mL的PBS缓冲液混匀，在工作3秒暂停2秒循环99次的条件下超声破碎后，离心收集上清。将细胞破碎液离心
所得的上清液与binding buffer按1：本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种重组细胞色素P450酶，其特征在于：重组细胞色素P450酶所编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。2.一种由权利要求1所述重组细胞色素P450的编码基因构建的重组载体，其特征在于：为质粒pET28b(+)-细胞色素P450。3.一种由权利要求2所述重组载体转化制备的重组基因工程菌，其特征在于：为重组大肠杆菌BL21(DE3)-pET28b(+)-细胞色素P450。4.如权利要求3所述的重组基因工程菌的制备方法，其特征在于依次进行如下步骤：(1)将重组细胞色素P450的编码基因克隆至外源基因表达质粒上，获得重组质粒；(2)将重组质粒转入大肠杆菌感受态细胞，接种至LB液体培养基，20～37℃、50～250r/min振荡培养0.5～2h，获得转化产物；(3)将转化产物涂布于含50μg/mL卡那霉素的平板，20～37℃培养，筛选获得含重组细胞色素P450编码基因的工程菌。5.根据权利要求4所述的重组基因工程菌的制备方法，其特征在于：所述外源基因表达质粒为下列之一：
①
pET系列，
②
pUC系列，
③
pGEM系列，
④
pBluescript系列。6.如权利要求1所述重组细胞色素P450的用途，其特征在于：降解二氯甲烷。7.如权利要求1所述重组细胞色素P450的用途，其特征在于：所述重组细胞色素P450在降解底物上具有广谱性。8.根据权利要求6所述的重组细胞色素P450的用途，其特征在于：将含重组细胞色素P450编码基因的工程菌经发酵培养，得发酵液；将发酵...
【专利技术属性】
技术研发人员：於建明，张燕，余志良，胡俊，楼子墨，
申请(专利权)人：浙江工业大学，
类型：发明
国别省市：
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