【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于基因工程、酶工程和生物，具体涉及一种来源于新金色分枝杆菌的细胞色素p450氧化酶及其基因工程菌株和它们在甾体化合物的生物转化中的应用。
技术介绍
1、甾体类药物是全球仅次于抗生素的第二大类药物，其生理活性多种多样，在现实生活中应用十分广泛。全球每年对甾体类药物有巨大的需求量，对甾体类药物合成的研究可以产生巨大的经济效益。早年，甾体类药物的合成多采用化学方法，其工艺复杂、成本高、产量低且污染大；近年来，大多以廉价易得的植物甾醇为底物，采用反应专一且高效、成本低、反应条件温和、污染小的微生物转化法获得所需的甾体类药物。
2、甾体的羟基化对于临床应用非常重要，因为这种特殊的修饰增强了甾体药物的生物活性。最早在工业生产中应用的羟化反应是利用黑根霉将黄体酮转化生成11α-羟基衍生物。从那时起，微生物羟基化反应在甾体类药物的工业生产中便广泛使用，早期工业上通过微生物进行的甾体羟化反应大部分是由真菌的生长细胞或静息细胞完成的，目前发现不仅真菌可以使甾体发生羟基化反应，微生物的羟化反应还可以在细菌中进行，例如分枝杆菌、简单节杆菌、大肠杆菌等，并且这些原核生物在甾体药物合成领域具有更广泛的应用价值。
3、细胞色素p450氧化酶对甾体的微生物转化可视为微生物对外源性甾体化合物的解毒过程。细胞色素p450氧化酶代表着一个很大的可自身氧化的亚铁血红素蛋白家族，属于单加氧酶类，因其在450纳米有特异吸收峰而得名，其可在体内催化多种反应且主要为单加氧反应。细胞色素p450氧化酶的主要作用是催化非活性基团r-h的羟基化反
4、在可以完全代谢植物甾醇或胆固醇的菌种，如新金色分枝杆菌、耻垢分枝杆菌、偶发分枝杆菌、诺卡氏菌和红球菌中，除了cyp125、cyp124、cyp142外，还存在多个细胞色素p450氧化酶基因，但对它们在甾体代谢中的作用还了解甚少。
技术实现思路
1、针对现有技术中存在的问题，本专利技术通过基因克隆表达方法，获得了具有甾体16-羟基化活性的p450酶及其基因，并将它们用于新型甾体中间体的制备。
2、具体地，本专利技术提供了一种来自新金色分枝杆菌的p450氧化酶及其氨基酸序列和核苷酸序列，以及包含所述p450氧化酶的基因的表达菌株。利用该表达菌株可有效地转化植物甾醇、胆固醇，或雄甾-4-烯-3,17-二酮(ad)、雄二烯二酮(add)、雄酮、雄诺龙、去氢表雄酮、宝丹酮或睾酮(ts，testosterone)等。
3、经过在cytochrome p450 homepage(http://drnelson.uthsc.edu/cytochromep450.html)中进行比对，发现该p450氧化酶属于cyp105家族，故命名该蛋白为cyp105x-1，其编码基因为cyp105x-1。该酶及其基因的获得为细菌p450氧化酶对甾体物质的16位羟基化奠定了理论和实践基础。
4、一方面，本专利技术提供了一种具有甾体化合物16位羟基化活性的细胞色素p450氧化酶，其氨基酸序列：
5、(1)如seq id no.1所示；
6、(2)为由seq id no.1所示氨基酸序列经过1、2、3、4或更多个氨基酸的缺失、取代或添加而得的氨基酸序列；或
7、(3)为与seq id no.1所示氨基酸序列具有73.60％以上的同源性的氨基酸序列。
8、根据本专利技术的一些实施方式，所述甾体化合物可以选自植物甾醇、胆固醇、雄甾-4-烯-3,17-二酮(ad)、雄二烯二酮(add)、9-羟基雄烯二酮(9-ohad)、雄酮、雄诺龙、去氢表雄酮、宝丹酮和睾酮(ts)中的一种或多种。
9、根据本专利技术的一些实施方式，所述73.60％以上的同源性可以为73.60％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同源性。
10、根据本专利技术的一些实施方式，所述与seq id no.1所示氨基酸序列具有73.60％以上的同源性的氨基酸序列可以如seq id no.3或5所示。
11、另一方面，本专利技术提供了一种编码根据本专利技术的细胞色素p450氧化酶的基因。
12、根据本专利技术的一些实施方式，所述基因的核苷酸序列可以为编码根据本专利技术的细胞色素p450氧化酶的氨基酸序列的核苷酸序列或包含编码根据本专利技术的细胞色素p450氧化酶的部分氨基酸序列的核苷酸序列。
13、根据本专利技术的一些实施方式，所述基因的核苷酸序列可以为编码氨基酸序列如seq id no.1、3或5所示的细胞色素p450氧化酶的核苷酸序列。
14、根据本专利技术的一些实施方式，所述基因的核苷酸序列：
15、(1)如seq id no.2、4或6所示；
16、(2)与seq id no.2、4或6所示核苷酸序列杂交的核苷酸序列；或
17、(3)与seq id no:2所示核苷酸序列具有90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或以上的同源性的核苷酸序列。
18、优选地，所述基因的核苷酸序列如seq id no.2所示。
19、再一方面，本专利技术提供了一种基因工程菌株，其为包含或表达编码根据本专利技术的细胞色素p450氧化酶或根据本专利技术的细胞色素p450氧化酶基因菌株。
20、本专利技术对于引入根据本专利技术的细胞色素p450氧化酶基因的宿主菌株没有特殊限制，其包括但不限于源自链霉菌属、芽孢杆菌属、假单胞菌属、棒杆菌属、节杆菌属、红球菌属、分枝杆菌菌属、大肠杆菌菌属或酵母菌属的菌株等。
21、优选地，所述基因工程菌株为表达根据本专利技术的细胞色素p450氧化酶基因的分枝杆菌。
22、优选地，根据本专利技术的基因工程菌株通过其获得的甾体化合物16位羟基化活性能够以高效率产生16位酮基甾体化合物和/或16位羟基甾体化合物。
23、优选地，所述基因工程菌株的基因组中引入根据本专利技术的细胞色素p450氧化酶基因。进一步优选地，所述基因工程菌株基因组中通过表达质粒或基因组插入引入根据本专利技术的细胞色素p450氧化酶基因。更优选地，所述基因工程菌株过表达根据本专利技术的细胞色素p450氧化酶基因。
24、优选地，所述基因工程菌株为保藏号为cgmcc no.25582的新金分枝杆菌(btad-16a)。
25、再一方面，本专利技术还提供了根据本专利技术的细胞色素p450氧化酶或根据本专利技术的基因工程菌在制备16位酮基甾体化合物和/或16位羟基甾体化合物中的用途。
26、根据本专利技术的一些实施方式，所述16位酮基甾体化合物可以为16-氧代睾酮(16-oxo-ts)。
27、根据本专利技术的一些实施方式，所述16位羟基甾体化合物可以为16-β-羟基雄甾-4-烯-3,17-二酮本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种具有甾体化合物16位羟基化活性的细胞色素P450氧化酶，其氨基酸序列：
2.一种编码根据权利要求1所述的细胞色素P450氧化酶的基因；
3.根据权利要求2所述的基因，其核苷酸序列：
4.一种基因工程菌株，其为包含或表达根据权利要求1所述的细胞色素P450氧化酶或根据权利要求2或3所述的基因的菌株；
5.根据权利要求1所述的细胞色素P450氧化酶或根据权利要求4所述的基因工程菌在制备16位酮基甾体化合物和/或16位羟基甾体化合物的用途。
6.根据权利要求5所述的用途，其中所述16位酮基甾体化合物为16-氧代睾酮；优选地，所述16位羟基甾体化合物为16-β-羟基雄甾-4-烯-3，17-二酮和/或16-α-羟基睾酮。
7.一种16位酮基甾体化合物和/或16位羟基甾体化合物的制备方法，其包括采用根据权利要求1所述的细胞色素P450氧化酶催化甾体化合物转化为16位酮基甾体化合物和/或16位羟基甾体化合物，或者采用根据权利要求4所述的基因工程菌转化甾体化合物为16位酮基甾体化合物和/或16位羟基甾体化合物。>
8.根据权利要求7所述的制备方法，其中所述甾体化合物选自植物甾醇、胆固醇、雄甾-4-烯-3，17-二酮、雄二烯二酮、9-羟基雄烯二酮、雄酮、雄诺龙、去氢表雄酮、宝丹酮和睾酮中的一种或多种；
9.根据权利要求7或8所述的制备方法，其中所述制备方法包括以下步骤：
10.根据权利要求9所述的制备方法，其中，在步骤(1)中，所述种子培养包括将所述基因工程菌接种于种子培养基中进行一级种子培养，然后转接于种子培养基中进行二级种子培养；
...【技术特征摘要】
1.一种具有甾体化合物16位羟基化活性的细胞色素p450氧化酶，其氨基酸序列：
2.一种编码根据权利要求1所述的细胞色素p450氧化酶的基因；
3.根据权利要求2所述的基因，其核苷酸序列：
4.一种基因工程菌株，其为包含或表达根据权利要求1所述的细胞色素p450氧化酶或根据权利要求2或3所述的基因的菌株；
5.根据权利要求1所述的细胞色素p450氧化酶或根据权利要求4所述的基因工程菌在制备16位酮基甾体化合物和/或16位羟基甾体化合物的用途。
6.根据权利要求5所述的用途，其中所述16位酮基甾体化合物为16-氧代睾酮；优选地，所述16位羟基甾体化合物为16-β-羟基雄甾-4-烯-3，17-二酮和/或16-α-羟基睾酮。
7.一种16位酮基甾体化合...
【专利技术属性】
技术研发人员：邹雷，常尚风，黎雪，
申请(专利权)人：沈阳博泰生物制药有限公司，
类型：发明
国别省市：
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