【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及医药领域，涉及一种利用成肌细胞分化指标进行药物筛选的方法，用于筛选出对累及肌肉系统遗传性疾病有治疗作用的药物。
技术介绍
1、近年来，基因组学、转录组学和蛋白组学技术的进步使越来越多与肌肉相关的致病基因被我们所发现，这让我们对累及肌肉系统的遗传性疾病的认识得到了极大的发展。然而目前这类疾病缺少逆转甚至治愈疾病的疗法，大多数只有对症治疗方案可供选择，这只能延缓疾病的进展。因此，有许多研究都致力于开发针对此类疾病的特异性药物，如杜氏肌营养不良症和线粒体脑肌病等。但同时，由于患者之间个体差异的存在，同一药物或药物组合所表现出来的疗效存在极大的差异。故个体化治疗方案的制定显得尤为重要。
2、肌肉活检是累及肌肉系统的遗传性疾病确诊不可或缺的一个辅助项目。活检手术中，需要对所得肌肉组织块边缘进行修整，该过程产生的组织碎块既往被视为医疗废物，其中含有维持骨骼肌再生能力的一群小型的成体干细胞即成肌细胞，该细胞直接来源于患者，可为患者天然存在的基因缺陷提供临床上最为相关的样本。
3、虽然国际上已有研究用永生化的人类成肌细胞制作模型并进行药物治疗实验，但目前均停留于实验室，缺少真实的患者疗效验证，且其检测指标均局限于一种疾病，缺乏普适性，这使得药物筛选模型只限于一种疾病，无法在累及肌肉系统遗传性疾病这一类疾病中进一步推广。
4、综上，现在还没有一种具有普适性的药物筛选方法，用于筛选出对累及肌肉系统遗传性疾病有治疗作用的物质。
技术实现思路
1、鉴于上述
2、本专利技术采用的具体方案为：
3、第一方面，本专利技术请求保护一种利用成肌细胞分化指标进行药物筛选的方法，所述方法是将待测物质加入到成肌细胞分化培养基中，检测成肌细胞分化特征性蛋白表达量变化，其恢复水平即代表待测物质的疗效，从而筛选对累及肌肉系统遗传性疾病有治疗作用的物质。
4、作为对上述方法的进一步优化，上述方法，包括以下步骤：
5、a、获取人源原代成肌细胞并利用逆转录病毒过表达cdk4及tert的方式诱导成肌细胞永生化；
6、b、验证永生化成肌细胞的增殖和分化能力；
7、c、药物筛选：将永生化成肌细胞接种于培养基中，将待测物质加入到成肌细胞的分化培养基中诱导分化；通过检测成肌细胞分化特征性蛋白表达量变化来判断待测物质对细胞分化的促进作用，从而代表待测物质的疗效。
8、作为对上述方法的进一步优化，步骤a中，在诱导成肌细胞永生化后，利用差速贴壁的方法纯化永生化成肌细胞。更进一步地，纯化后，对永生化成肌细胞进行细胞检验，所述细胞检验包括：利用流式细胞术检测所得细胞的cd56阳性率，对所得永生化成肌细胞细胞的纯度进行检验；对细胞的dna提取物进行特定片段的pcr扩增，同时对产物进行测序，验证所得细胞的基因型是否与原代一致。
9、作为对上述方法的进一步优化，步骤c的具体过程为：设计成肌细胞分化特征性蛋白的特异性引物，包括：myh2、myh3、myh7、myod、pax7；将永生化的成肌细胞按1×104cells/cm2的密度接种于培养皿中，待汇合度达到80%时，换液含浓度梯度待测物质的成肌细胞分化培养基诱导分化，且在分化阶段隔天半换液；诱导分化第四天时，提取细胞总rna进行实时荧光定量pcr检测待测药物对成肌细胞分化特征性蛋白表达量的影响。
10、更进一步地， 针对myh2靶点的特异性引物如seq id no：1~2所示；针对myh3靶点的特异性引物如seq id no：3~4所示；针对myh7靶点的特异性引物如seq id no：5~6所示；针对myod靶点的特异性引物如seq id no：7~8所示；针对pax7靶点的特异性引物如seq idno：9~10所示。
11、第二方面 ，本专利技术请求保护上述方法在累及肌肉系统遗传性疾病药物筛选中的应用。
12、有益效果：本专利技术中提供了一种适用于累及肌肉系统遗传性疾病的具有普适性的药物筛选方法，利用成肌细胞分化特征性蛋白的表达量检测待测物质的疗效。此方法操作简单，而且本专利技术还具有广泛的适用性。本专利技术中利用病理机制明确，且药物临床疗效显著的患者标本作为切入点，发现了成肌细胞分化特征性蛋白表达量变化与患者个体层面的症状改善相对应，可用于观察待测物质的疗效。因此，可将所述蛋白表达量变化指标用于建立一种具有普适性的药物筛选方法，用于筛选出对累及肌肉系统遗传性疾病有治疗作用的物质。
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1.一种利用成肌细胞分化指标进行药物筛选的方法，其特征在于：所述方法是将待测物质加入到成肌细胞分化培养基中，检测成肌细胞分化特征性蛋白表达量变化，其恢复水平即代表待测物质的疗效，从而筛选对累及肌肉系统遗传性疾病有治疗作用的物质。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述方法包括以下步骤：
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤A中，在诱导成肌细胞永生化后，利用差速贴壁的方法纯化永生化成肌细胞。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：纯化后，对永生化成肌细胞进行细胞检验，所述细胞检验包括：利用流式细胞术检测所得细胞的CD56阳性率，对所得永生化成肌细胞细胞的纯度进行检验；对细胞的DNA提取物进行特定片段的PCR扩增，同时对产物进行测序，验证所得细胞的基因型是否与原代一致。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤C的具体过程为：设计成肌细胞分化特征性蛋白的特异性引物，包括：MYH2、MYH3、MYH7、MyoD、Pax7；将永生化的成肌细胞按1×104cells/cm2的密度接种于培养皿中，待汇合度达到80%时
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：针对MYH2靶点的特异性引物如SEQ ID NO：1~2所示；针对MYH3靶点的特异性引物如SEQ ID NO：3~4所示；针对MYH7靶点的特异性引物如SEQ ID NO：5~6所示；针对MyoD靶点的特异性引物如SEQ ID NO：7~8所示；针对Pax7靶点的特异性引物如SEQ ID NO：9~10所示。
7.根据权利要求1-6任意一种所述的方法在累及肌肉系统遗传性疾病药物筛选中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种利用成肌细胞分化指标进行药物筛选的方法，其特征在于：所述方法是将待测物质加入到成肌细胞分化培养基中，检测成肌细胞分化特征性蛋白表达量变化，其恢复水平即代表待测物质的疗效，从而筛选对累及肌肉系统遗传性疾病有治疗作用的物质。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述方法包括以下步骤：
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤a中，在诱导成肌细胞永生化后，利用差速贴壁的方法纯化永生化成肌细胞。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：纯化后，对永生化成肌细胞进行细胞检验，所述细胞检验包括：利用流式细胞术检测所得细胞的cd56阳性率，对所得永生化成肌细胞细胞的纯度进行检验；对细胞的dna提取物进行特定片段的pcr扩增，同时对产物进行测序，验证所得细胞的基因型是否与原代一致。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤c的具体过程为：设计成肌细胞分...
【专利技术属性】
技术研发人员：蒋海山，张钊涌，胡亚芳，李伟，
申请(专利权)人：南方医科大学南方医院，
类型：发明
国别省市：
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