一种新金分枝杆菌及其用途制造技术

本发明专利技术提供一种新金分枝杆菌及其用途。本发明专利技术提供了一种用于将植物甾醇转化为HIL的新金分枝杆菌MN HIL‑4，该新金分枝杆菌的保藏编号为CGMCC No.17948。本发明专利技术还提供了上述新金分枝杆菌MN HIL‑4的种子培养物。本发明专利技术提供一种制备HIL的方法，所述方法包括使用本发明专利技术的新金分枝杆菌MN HIL‑4或其种子培养物将植物甾醇转化为HIL。该菌株以植物甾醇为底物，转化HIL的重量收率为53.83％(g/g％)植物甾醇(折纯)，HIL的产率是已公开菌株HIL产率的7.88倍。以植物甾醇为底物，发酵液中HIL产物占比为99.29％，产物中无常见副产物HIP和HK，副产物的产率大大低于已公开菌株。

【技术实现步骤摘要】
一种新金分枝杆菌及其用途
本专利技术属于生物工程领域，涉及一种新金分枝杆菌及其在制备甾体化合物中间体HIL中的用途。
技术介绍
甾体激素类药物是我国医药领域的重要门类，在临床上被广泛使用。但是，因为甾体化合物结构复杂，合成步骤多，生产工艺复杂，污染大，收率低，导致其成本很高，经济效益薄弱。近年来，发现一些微生物，如诺卡氏菌、假单胞菌、分枝杆菌、节杆菌等能以甾醇为唯一碳源生长，随后又发现细菌、放线菌、酵母、霉菌中的某些菌株可以使甾体化合物的特定部位发生转化，其反应专一性表现出了巨大优势。因此，微生物降解甾醇生产甾体药物中间体已逐渐成为现代医药工业生产甾体激素类药物的主流，占据着极其重要的地位。甾体类物质在上述菌中的降解为有氧降解，以分支杆菌降解胆固醇为例，其降解过程为：一、胆固醇(I，cholesterol)转化为胆甾-4-烯-3-酮(cholest-4-en-3-one)；二、侧链降解：与第一步的氧化同时进行，过程类似于脂肪酸的β-氧化，在一系列酶的催化下，生成一种重要的甾体激素前体物质雄甾-4-烯-3,17-二酮(II，androst-4-ene-3,17-dione，简称AD)；三、中心环的降解：在一系列酶作用下，AD分裂为2-羟-2,4-二烯己酸(III，2-hydroxyhexa-2,4-dienoicacid)和9,17二氧代-1,2,3,4,10,19-六降雄甾烷-5-羧酸(IV，9,17-dioxo-1,2,3,4,10,19-hexanorandrostan-5-oicacid，简称HIP)；四、下游降解途径：2-羟-2,4-二烯己酸经过一系列酶逐步分解，能量进入三羧酸循环，而HIP被转化为3aα-H-4α-(3’-丙酸)-5α-羟基-7aβ-甲基六氢-1-印酮-δ-内酯(V，3aα-H-4α-(3’-propionicacid)-5α-hydroxy-7aβ-methylhexahydro-1-indanone-δ-lactone，简称HIL)，进一步被完全降解为CO2和H2O。其中，HIL即本申请的δ-内酯，又称为A环降解物等，CAS号：64053-02-7，是合成雌酚酮、雌二醇及其衍生物等重要药物或中间体。现有技术中存在利用微生物降解植物甾醇直接制备HIL的报道，具体地US4,042,459中公开的NRRLB-8128和CN103756940A中公开的NK-XHX-103，虽然可以降解植物甾醇积累HIL，但同时产生大量的副产物，HIL收率较低，重量收率为8.05-39％，生产成本高，产业化困难。因此，当前对生产成本低，工艺简单的HIL的生产方法存在需求。
技术实现思路
因此，本专利技术的目的是针对现有技术的不足，提供一种新金分枝杆菌突变株。本专利技术提供的新金分枝杆菌突变株能够将植物甾醇大量转化为HIL。本专利技术还提供了基于该新金分枝杆菌制备HIL的方法。使用本专利技术的新金分枝杆菌制备HIL的方法与已有方法相比，HIL得率高、副产物少，并且对环境没有污染。此外，本专利技术的菌株MNHIL-4具有高产、性状稳定的特点，该菌株经过6个月的传代，性能保持稳定。根据本专利技术提供的一种新金分枝杆菌的突变株，可将植物甾醇转化为HIL，并且能够减少HIP、HK等副产物。其中，在本申请中，除非特别说明，HIP、HIL及HK分别为如下所示的化合物：HIP为9,17二氧代-1,2,3,4,10,19-六降雄甾烷-5-羧酸，由下式IV表示：HIL，又称为δ-内酯，为3aα-H-4α-(3’-丙酸)-5α-羟基-7aβ-甲基六氢-1-印酮-δ-内酯，由下式V表示：HK，为3aα-H-4α-(3’-丙醇)-7aβ-甲基六氢-1,5-印二酮半缩酮，由下式VI表示：具体地，本专利技术是通过以下技术方案实现的：一方面，本专利技术提供一种用于将植物甾醇转化为HIL的新金分枝杆菌(Mycobacteriumneoaurum)MNHIL-4，该新金分枝杆菌的保藏编号为CGMCCNo.17948。该菌株已于2019年06月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，分类命名为新金分枝杆菌：(MycobacteriumneoaurumMNHIL-4)，保藏号为CGMCCNo.17948。该菌株具有下述性质：1、菌落形态学特征：将本专利技术的菌株于32℃下，在营养固体培养基上培养生长，3-5天后，得到直径约为3～10mm的金黄色菌落，菌落呈圆形，表面光滑。2、菌株形态学特征：本专利技术的菌株显微镜下呈现圆杆状，与分枝杆菌属镜下形态一致。3、生理与生化特性：本专利技术的菌株培养温度为28-32℃，最适生长温度为32℃，并且在pH为7.0-7.6的条件下生长较好。4、营养特征：本专利技术的菌株无需特殊营养素，使用基础培养基例如营养肉汤培养基培养，专性需氧。另一方面，本专利技术提供了所述菌株的制备方法，所述方法包括使用亚硝基胍诱变新金分枝杆菌。具体地，所述方法包括使用亚硝基胍诱变新金分枝杆菌菌株MNPJ-1(保藏号为CGMCCNo.14181)获得。再一方面，本专利技术提供了上述新金分枝杆菌MNHIL-4的种子培养物。其中，所述种子培养物通过培养新金分枝杆菌MNHIL-4制备获得，是该新金分枝杆菌MNHIL-4的种子培养物。再一方面，本专利技术提供了一种制备新金分枝杆菌MNHIL-4的种子培养物的方法，所述方法包括以下步骤：将新金分枝杆菌MNHIL-4接种于种子培养基，振荡培养36～60小时，收集发酵液，得到种子培养物；其中，所述种子培养基包含以下组分：牛肉膏0.1～0.5g/L，蛋白胨0.5～1.5g/L，酵母粉0.2～0.4g/L，甘油1.0～2.0g/L，吐温1.5～2.5g/L，pH7.0～7.4；优选地，所述种子培养基包含：牛肉膏0.3g/L，蛋白胨1.0g/L，酵母粉0.3g/L，甘油1.5g/L，吐温2.0g/L，pH7.2。优选地，所述种子培养基的制备中，将各组分与水混合后，调节pH，高压蒸汽121℃灭菌30分钟，冷却后使用。更优选地，所述种子培养物通过包括以下步骤的方法获得：将新金分枝杆菌MNHIL-4(例如保存于1mL冷冻甘油管的菌株)接种于种子培养基，在28～32℃下、优选地在32℃下，以200～250转/分钟、优选220转/分钟振荡培养36～60小时，优选48小时，收集发酵液，得到种子培养物。本专利技术提供的上述新金分枝杆菌MNHIL-4或种子培养物均可用于制备HIL。再一方面，本专利技术提供新金分枝杆菌MNHIL-4或者其种子培养物在制备HIL中的用途。还一方面，本专利技术提供一种制备HIL的方法，所述方法包括使用本专利技术的新金分枝杆菌MNHIL-4或其种子培养物将植物甾醇转化为HIL。本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于将植物甾醇转化为HIL的新金分枝杆菌(Mycobacterium neoaurum)MNHIL-4，该新金分枝杆菌的保藏编号为CGMCC No.17948。/n

【技术特征摘要】
1.一种用于将植物甾醇转化为HIL的新金分枝杆菌(Mycobacteriumneoaurum)MNHIL-4，该新金分枝杆菌的保藏编号为CGMCCNo.17948。


2.根据权利要求1所述的新金分枝杆菌MNHIL-4的种子培养物。


3.根据权利要求2所述的种子培养物的制备方法，所述方法包括以下步骤：
将根据权利要求1所述的新金分枝杆菌MNHIL-4接种于种子培养基，振荡培养36～60小时，收集发酵液，得到种子培养物；
其中，所述种子培养基包含以下组分：
牛肉膏0.1～0.5g/L，蛋白胨0.5～1.5g/L，酵母粉0.2～0.4g/L，甘油1.0～2.0g/L，吐温1.5～2.5g/L，pH7.0～7.4；
优选地，所述种子培养基包含：牛肉膏0.3g/L，蛋白胨1.0g/L，酵母粉0.3g/L，甘油1.5g/L，吐温2.0g/L，pH7.2。


4.根据权利要求3所述的方法，其中，所述种子培养物通过包括以下步骤的方法获得：
将新金分枝杆菌MNHIL-4接种于种子培养基，在28～32℃下、优选地在32℃下，以200～250转/分钟、优选220转/分钟振荡培养36～60小时，优选48小时，收集发酵液，得到种子培养物。


5.根据权利要求1所述的新金分枝杆菌MNHIL-4或者根据权利要求2所述的新金分枝杆菌MNHIL-4的种子培养物在制备HIL中的用途。


6.一种制备HIL的方法，所述方法包括使用根据权利要求1所述的新金分枝杆菌MNHIL-4或者根据权利要求2所述的新金分枝杆菌MNHIL-4的种子培养物将植物甾醇转化为HIL。


7.根据权利要求6所述的方法，其中，所述方法包括以下步骤：
1)将新金分枝杆菌MNHIL-4或其种子培养物接种于包含植物甾醇的转化培养基中发酵培养；
2)从步骤1)得到的发酵培养液中...

【专利技术属性】
技术研发人员：常慧，
申请(专利权)人：沈阳博泰生物制药有限公司，
类型：发明
国别省市：辽宁;21