一个参与甘蓝型油菜叶绿素合成相关基因BnaC08-CYP705a12及其应用制造技术

本发明专利技术为基因工程技术领域，具体涉及一个参与叶绿素合成相关的基因BnaC08

【技术实现步骤摘要】
一个参与甘蓝型油菜叶绿素合成相关基因BnaC08-CYP705a12及其应用


[0001]本专利技术属于植物基因工程
，具体涉及一种参与甘蓝型油菜叶绿素合成相关的DNA片段(基因)的分离克隆、功能验证及其应用。

技术介绍

[0002]叶是高等植物进行光合作用的主要场所，植物叶色的变化会引起叶片光合效率的改变，对植物叶色突变体的研究可以阐明叶色对于光合作用影响的调控机理，可以为植物高光效研究提供良好的理论基础和研究材料。
[0003]叶绿素合成和血红素生物合成是四吡咯合成代谢的两个重要分支。高等植物叶绿素的生物合成以谷氨酸与a-酮戊二酸为原料合成ALA。2分子ALA经ALA脱水酶ALAD催化生成1分子胆色素原，其具有毗咯环。4分子胆色素原经脱氨基催化形成尿卟琳原Ⅲ，尿卟啉原Ⅲ的4个乙酸侧链经过尿卟啉原Ⅲ脱羧酶生成具有4个甲基的粪卟啉原Ⅲ。粪卟啉原Ⅲ在粪卟啉原Ⅲ氧化酶和原卟啉原氧化酶再脱梭、脱氢、氧化形成原卟啉Ⅳ，原卟啉IX是形成叶绿素或亚铁血红素的分水岭。如果与镁结合，则形成Mg-原卟啉Ⅳ，再经Mg-原卟啉Ⅳ甲基转移酶、Mg-原卟啉Ⅳ单甲基酯环化酶和二乙烯还原酶形成原叶绿酸酯。原叶绿酸酯经光还原生成叶绿酸酯a，然后在叶绿素合酶下催化形成叶绿素a，叶绿素b由叶绿素a转化而成。叶绿素合成的过程涉及多个酶的参与。叶绿素合成过程中任何一个基因的突变都可能造成叶绿素合成受阻，进而改变叶绿体中各类色素的含量，引起植株叶色变异。如果原卟啉Ⅳ与铁结合形成Fe
2+
螯合物，接着生成血红素b，植物体内血红素b经过一系列氧化还原最终形成光敏色素生色团。若血红素代谢反应相关基因突变,四吡咯代谢的平衡很可能会打破，导致细胞内血红素含量上升，血红素的积累通过反馈抑制Glu-tRNA还原酶的活性来影响ALA和原叶绿素酸值含量，从而抑制叶绿素的合成，突变体由于缺乏叶绿素使得叶色产生变异。血红素反馈抑制是叶绿素合成过程中关键的调控步骤。在番茄aurea和yenow-green-2突变体中，编码血红素氧化酶和光敏色素生色团合酶的基因变异，导致细胞内血红素积累过量，其反馈抑制叶绿素前体氨基酮戊酸的合成，致使突变体表现为叶片黄化。
[0004]细胞色素P450单加氧酶(P450s)是一个保守的血红素硫蛋白基因超家族，在多种多样的基质代谢中起着很重要的作用，包括内源性和外源性化合物的代谢。细胞色素P450的三维结构非常保守，在所有已知结构的CYP450中都含有一个保守的特征性亚铁血红素结合域FxxGxRxCxG位于其催化中心部位，而且序列非常保守，此区域也是鉴定细胞色素P450的关键依据。此结构域部位中的半胱氨酸(C)在所有的P450中完全保守，是亚铁血红素结合位点的第5个轴配体。细胞色素P450催化的反应过程是将电子从NADPH/NADP传至黄素蛋白和铁硫蛋白，然后再传递给细胞色素P450氧化酶。由于大多数P450在植物体内的含量很低且不稳定，直接分离纯化P450酶非常困难，因此克隆P450基因，研究P450基因的表达与调控，通过异源表达、缺失突变和突变体互补等方法研究P450的功能就成为一条重要途径。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的在于提供一个参与甘蓝型油菜叶绿素合成相关的基因，本专利技术所述的BnaC08-CYP705a12基因能够参与叶绿素的合成，从而控制油菜叶片性状。
[0006]本专利技术所提供的参与甘蓝型油菜叶绿素合成相关的基因，名称为BnaC08-CYP705a12(Brassica napus CYTOCHROME P450,FAMILY 705,SUBFAMILY A,POLYPEPTIDE 12)，从一个甘蓝型油菜黄化突变体材料“cde1”中克隆得到的基因片段，与野生型ZS11中克隆的序列有1个碱基的替换。
[0007]一个参与甘蓝型油菜叶绿素合成相关的基因BnaC08-CYP705a12，是下述氨基酸残基序列之一，与野生型ZS11有1个氨基酸残基的替换，位于aa-320：
[0008](1)序列表中的SEQ ID NO：1；
[0009](2)将序列表中SEQ ID NO：1的氨基酸残基序列经过一个至十个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有参与甘蓝型油菜叶绿素合成功能的蛋白质。
[0010]序列表中的SEQ ID NO：1由492个氨基酸残基组成，自氨基端(N端)第15-491位氨基酸残基为保守序列。
[0011]所述取代和/或缺失和/或添加的一至十个氨基酸残基为非结构域中的氨基酸残基，其改变不会对该蛋白的功能产生影响。
[0012]编码本专利技术参与甘蓝型油菜叶绿素合成相关基因BnaC08-CYP705a12(Brassica napus CYTOCHROME P450,FAMILY 705,SUBFAMILY A,POLYPEPTIDE 12)，其cDNA是下述核苷酸序列之一，与野生型ZS11中克隆的序列有1个碱基的替换，位于自5
’
端第959位碱基：
[0013](1)序列表中SEQ ID NO：2的DNA序列；
[0014](2)编码序列表中SEQ ID NO：1的DNA序列；
[0015](3)与序列表中SEQ ID NO：2限定的DNA序列具有90％以上同源性且具有参与甘蓝型油菜叶绿素合成的核苷酸序列；
[0016](4)在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID NO：2限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。
[0017]所述高严谨条件为在0.1
×
SSPE(或0.1
×
SSC)、0.1％SDS的溶液中，65℃条件下杂交并洗膜。
[0018]序列表中的SEQ ID NO：2由1479个碱基组成，其编码序列为5
’
端第1-1479位碱基，编码具有序列表中SEQ ID NO：1的氨基酸残基序列的蛋白质，自5
’
端第43-1473位碱基编码保守序列。
[0019]其基因组基因，是下述核苷酸序列之一：
[0020](1)序列表中SEQ ID NO：3的DNA序列；
[0021](2)与序列表中SEQ ID NO：3限定的DNA序列具有90％以上同源性且具有参与甘蓝型油菜叶绿素合成的核苷酸序列；
[0022](3)在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID NO：3限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。
[0023]所述高严谨条件为在0.1
×
SSPE(或0.1
×
SSC)、0.1％SDS的溶液中，65℃条件下杂交并洗膜。
[0024]序列表中的SEQ ID NO：3由1896个碱基组成，自5
’
端第1-672位碱基为该基因组基
因的第一个外显子，自5
’
端第673-699位碱基为该基因组基因的第一个内含子，自5
’
端第700-907位碱基为该基因组基因的第二个外显子，自5
’
...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一个参与甘蓝型油菜叶绿素合成相关基因，其特征在于，所述基因是下述氨基酸残基序列之一：(1)序列表中的SEQ ID NO：1；(2)将序列表中SEQ ID NO：1的氨基酸残基序列经过一个至十个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有参与甘蓝型油菜叶绿素合成功能的蛋白质；序列表中的SEQ ID NO：1由492个氨基酸残基组成，自氨基端(N端)第15-491位氨基酸残基为保守序列。2.根据权利要求1所述的参与甘蓝型油菜叶绿素合成相关的基因，其特征在于，所述氨基酸残基为非结构域中的氨基酸残基，其改变不会对该蛋白的功能产生影响。3.根据权利要求1所述的参与甘蓝型油菜叶绿素合成相关的基因，其特征在于，其cDNA是下述核苷酸序列之一：(1)序列表中SEQ ID NO：2的DNA序列；(2)编码序列表中SEQ ID NO：1的DNA序列；(3)与序列表中SEQ ID NO：2限定的DNA序列具有90％以上同源性且具有参与甘蓝型油菜叶绿素合成相关的核苷酸序列；(4)在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID NO：2限定的DNA序列杂交的核苷酸序列；所述高严谨条件为在0.1
×
SSPE(或0.1
×
SSC)、0.1％SDS的溶液中，65℃条件下杂交并洗膜。4.根据权利要求3所述的参与甘蓝型油菜叶绿素合成相关的基因，其特征在于，序列表中的SEQ ID NO：2由1479个碱基组成，其编码序列为5
’
端第1-1479位碱基，编码具有序列表中SEQ ID NO：1的氨基酸残基序列的蛋白质，自5
’
端第43-1473位碱基编码保守序列。5.根据权利要求1所述的参与甘蓝型油菜叶绿素合成相关的基因，其特征在于，其基因组基因，是下述核苷酸序...

【专利技术属性】
技术研发人员：管荣展，杨茂，樊浩，万书贝，陈文静，
申请(专利权)人：南京农业大学，
类型：发明
国别省市：