一种蓝莓果中儿茶酚氧化酶的提取和纯化方法技术

本发明专利技术涉及一种蓝莓果中儿茶酚氧化酶的提取和纯化方法。提取方法具体为：在0～4℃的条件下，将蓝莓果按料液比为1：1～4的比例加入弱酸性缓冲液中，制成均匀浆质；然后再离心处理，取上清液，即得蓝莓果儿茶酚氧化酶提取液；其中，所述弱酸性缓冲液中添加有酚类螯合剂和表面活性剂，所述酚类螯合剂的添加量1～7％；所述表面活性剂的添加量为0～1.5％。纯化方法包括粗酶液的硫酸铵分级沉淀，粗酶液的透析处理，粗酶液的离子交换层析纯化，酶液的凝胶层析纯化以及非变性凝胶电泳纯化。本发明专利技术能够准确地将几种分子量不同的儿茶酚氧化酶进行分离，最终获得纯度较高的酶。最终获得纯度较高的酶。最终获得纯度较高的酶。

【技术实现步骤摘要】
一种蓝莓果中儿茶酚氧化酶的提取和纯化方法


[0001]本专利技术属于酶分离、纯化
，具体涉及一种蓝莓果中儿茶酚氧化酶的提取和纯化方法。

技术介绍

[0002]儿茶酚氧化酶也称为多酚氧化酶或邻二酚氧化酶(COs；EC1.10.3.1)是一种含铜的核编码氧化酶，广泛存在于植物组织中。尽管它缺乏羟化酶活性，但其可以催化氧化具有邻苯二酚结构的物质成为相应的醌类，而这些醌类通过聚合最终形成黑色或者褐色色素。众多研究者发现儿茶酚氧化酶不仅导致果蔬的褐变，其在植物逆境胁迫防御、次生代谢及细胞死亡方面都有着非常重要的作用。此外，儿茶酚氧化酶在生物传感器形成，食品工业，医药和废水处理领域具有广泛的应用。
[0003]随着研究技术和设备的发展，儿茶酚氧化酶更多的信息将会被挖掘出来，人们也将会根据其自身的结构特征、生理功能或者用途进行细致划分。然而现阶段有关儿茶酚氧化酶纯化的研究较少，其中能够成功获得有活性且纯度较高的儿茶酚氧化酶的案例十分有限。此外，现有的研究也发现不同的植物组织中儿茶酚氧化酶的结构有一定的差异，特别是酶的一级结构和亚基数量，这也就导致了其提取、纯化的方法通用性较差。
[0004]蓝莓果是一种具有代表性的热敏性浆果，也是一种研究果实酶促褐变问题和儿茶酚氧化酶生理功能及用途的良好材料。一方面是因为蓝莓果中富含酚酸、类黄酮、花色苷等酚类物质，这些物质可能是儿茶酚氧化酶的潜在底物；另一方面，部分蓝莓品种的全基因组已经公布于GENOMEDATABASEFOR VACCINIUM(www.vaccinium.org/)网站上，这将为深入研究蓝莓果实中儿茶酚氧化酶的蛋白结构、生理功能及用途提供丰富的生物学信息支持。然而，现阶段人们未能从蓝莓果实中获得具有活性且纯度较高的天然儿茶酚氧化酶。

技术实现思路

[0005]本专利技术的第一个目的在于提供了一种蓝莓果中儿茶酚氧化酶的提取方法。
[0006]所述提取方法具体为在0～4℃的条件下，将蓝莓果按料液比为1：1～4的比例加入弱酸性缓冲液中，制成均匀浆质；然后再离心处理，取上清液，即得蓝莓果儿茶酚氧化酶提取液；
[0007]其中，所述弱酸性缓冲液中添加有酚类螯合剂和表面活性剂，所述酚类螯合剂的添加量(g
·
mL-1
)为1～7％；所述表面活性剂的添加量为0～1.5％。
[0008]由于蓝莓果中富含多种酚类物质，这些物质可能会影响儿茶酚氧化酶的活性，因此本专利技术在蓝莓果匀浆过程中添加了酚类螯合剂，从而减少酚类对儿茶酚氧化酶活性的影响；
[0009]其中，所述酚类螯合剂为PVPP、PVP中的一种或两种；优选为PVPP和PVP的混合物，质量比为1.8～2.2:1；最优选为2:1。
[0010]进一步提出的，当所述料液比为1:3～4时，提取效果最优。
[0011]优选的，所述弱酸性缓冲液的pH值为5.8～6.2；
[0012]优选的，所述弱酸性缓冲液为柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液。
[0013]优选的，所述酚类螯合剂的添加量(g
·
mL-1
)为1～3％。
[0014]优选的，所述表面活性剂的添加量(g
·
mL-1
)为0.5～1.5％。
[0015]进一步提出的，所述表面活性剂为非离子表面活性剂；优选为曲拉通X-100。曲拉通X-100是一种非离子表面活性剂也是一种良好的破膜剂，本专利技术将曲拉通X-100加入提取液中是为了破坏细胞或细胞器的膜结构，从而使得儿茶酚氧化酶能被充分的释放。
[0016]进一步提出的，所述离心处理前还包括冰浴超声，所述冰浴超声的功率为40～100W，时间为5～30min。使用冰浴超声是为了提高儿茶酚氧化酶的提取效率，需要注意的是超声处理时间不应过长，且功率不宜过高，避免将目标蛋白结构破坏致使其失活。由此，更优选所述超声的功率为40～60W，时间为5～10min。
[0017]本专利技术的第二个目的在于，提供一种蓝莓果中儿茶酚氧化酶的纯化方法，包括如下步骤：
[0018]1)将蓝莓果儿茶酚氧化酶提取液进行硫酸铵进行分级沉淀，获得粗酶液；
[0019]2)将粗酶液进行透析处理，获得酶液A；
[0020]3)将酶液A进行柱层析纯化，获得酶液B；
[0021]4)将酶液B进行非变性电泳纯化处理，具体如下：
[0022]a)将酶液B与非变性非还原上样缓冲液按体积比3.5～4.5:1的比例混合，获得酶液B1；将酶液B与甘油按体积比1～3:1的比例进行混合，获得酶液B2；
[0023]b)将酶液B1分别加入聚丙烯酰胺凝胶最左侧和最右侧的两个孔中；将酶液B2依次加入到聚丙烯酰胺凝胶剩余的孔中；在Hepes电泳缓冲液进行电泳，当溴酚蓝到达聚丙烯酰胺凝胶底部时电泳结束；
[0024]c)取出聚丙烯酰胺凝胶板，洗去电泳液，将所述聚丙烯酰胺凝胶板一侧的玻璃板剥离；将所述聚丙烯酰胺凝胶最左侧或最右侧的两孔胶由上到下按“Z”或“S”形缓慢切分并从玻璃板上剥离；然后将剥离的两孔胶进行酶染，将酶染后的两孔胶洗涤并脱色，将脱色后的两孔胶重新对接到聚丙烯酰胺凝胶板上，以两孔胶中酶条带的位置为参照，将未酶染的聚丙烯酰胺凝胶板中同一位置的凝胶进行切割回收，即得含蓝莓果儿茶酚氧化酶的胶条；
[0025]d)将所述蓝莓果儿茶酚氧化酶胶条碾碎，加水涡旋震荡，离心过滤取滤液，即得蓝莓果儿茶酚氧化酶酶液；
[0026]优选的，所述的非变性电泳纯化处理在0～4℃的温度下进行；
[0027]更优选的，所述步骤d)重复3～6次。
[0028]优选的，所述酶染采用的酶染液的为：浓度1～3％的邻苯二酚与浓度0.4～0.8％对苯二胺按5:2～3:1的比例进行混合；
[0029]优选的，所述脱色液为体积比为45～55:5:50～60的甲醇、乙酸和水。
[0030]优选的，聚丙烯酰胺凝胶的配制为浓缩胶4％、分离胶6％，缓冲系统为Hepes，所得制得的聚丙烯酰胺凝胶不含SDS及其他变性或还原的物质。
[0031]优选的，电泳液为Hepes电泳缓冲液。
[0032]进一步提出的，步骤1)所使用的硫酸铵分级沉淀是对蓝莓果儿茶酚氧化酶提取液的一种粗纯化，其目的就是为了除去大量的杂蛋白及其他杂质，尽可能的保留目标蛋白。
[0033]所述步骤1)具体为：
[0034]a)将硫酸铵缓慢加入到蓝莓果儿茶酚氧化酶提取液中，使其硫酸铵的饱和度为33～40％，然后静置10～15h，过滤，离心取上清液，获得粗酶液1；
[0035]b)将粗酶液1中缓慢加入硫酸铵，使其硫酸铵的饱和度为70～90％，然后静置10～15h，离心留沉淀和漂浮物加水复溶，获得粗酶液。
[0036]进一步提出的，所述步骤2)具体为：将所述粗酶液移入透析袋中，所述透析袋置于饱和度为30～50％的硫酸铵溶液中进行渗透压平衡；然后逐步更换更低饱和度的硫酸铵溶液直至硫酸铵饱和度为零；结束透析本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种蓝莓果中儿茶酚氧化酶的提取方法，其特征在于，在0～4℃的条件下，将蓝莓果按料液比为1：1～4的比例加入弱酸性缓冲液中，制成均匀浆质；然后再离心处理，取上清液，即得蓝莓果儿茶酚氧化酶提取液；其中，所述弱酸性缓冲液中添加有酚类螯合剂和表面活性剂，所述酚类螯合剂的添加量为1～7％，所述表面活性剂的添加量为0～1.5％。2.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，所述料液比为1:3～4；所述酚类螯合剂的添加量为1～3％；所述表面活性剂的添加量为0.5～1.5％；优选的，所述弱酸性缓冲液的pH值为5.8～6.2；更优选的，所述弱酸性缓冲液为柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液。3.根据权利要求1或2所述的提取方法，其特征在于，所述酚类螯合剂为PVPP、PVP中的一种或两种；优选为质量比为1.8～2.2:1的PVPP和PVP混合；和/或，所述表面活性剂为非离子表面活性剂；优选为曲拉通X-100。4.根据权利要求1～3任一项所述的提取方法，其特征在于，所述离心处理前还包括冰浴超声，所述冰浴超声的功率为40～100W，时间为5～30min；优选的，所述冰浴超声的功率为40～60W，时间为5～10min。5.一种蓝莓果中儿茶酚氧化酶的纯化方法，其特征在于，包括如下步骤：1)蓝莓果儿茶酚氧化酶提取液采用硫酸铵进行分级沉淀，获得粗酶液；2)将粗酶液进行透析处理，获得酶液A；3)将酶液A进行柱层析纯化，获得酶液B；4)将酶液B进行非变性电泳纯化处理，具体如下：a)取少量的酶液B与非变性非还原上样缓冲液按体积比3.5～4.5:1的比例混合，获得酶液B1；将剩余的酶液B与甘油按体积比1～3:1的比例进行混合，获得酶液B2；b)将酶液B1分别加入聚丙烯酰胺凝胶最左侧和最右侧的两个孔中；将酶液B2依次加入到聚丙烯酰胺凝胶剩余的孔中；在Hepes电泳缓冲液中进行电泳，当溴酚蓝到达聚丙烯酰胺凝胶底部时电泳结束；c)取出聚丙烯酰胺凝胶板，洗去电泳液，将所述聚丙烯酰胺凝胶板一侧的玻璃板剥离；将所述聚丙烯酰胺凝胶最左侧或最右侧的两孔胶由上到下按“Z”或“S”形缓慢切分并从玻璃板上剥离；然后将剥离的两孔胶进行酶染，将酶染后的两孔胶洗涤并脱色，将脱色后的两孔胶重新对接到聚丙烯酰胺凝胶板上，以上述两孔胶中酶条带的位置为参照，将未酶染的聚丙烯酰胺凝胶板中同一位置的凝胶进行切割回收，即得含蓝莓果儿茶酚氧化酶的胶条；d)将所述胶条碾碎，加水涡旋震荡，离心过滤取滤液，即得蓝...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙爱东，韦玉龙，于宁，朱月，甘芝霖，郝静怡，史君彦，甲承立，
申请(专利权)人：北京林业大学，
类型：发明
国别省市：