一种参与挥发性成分形成的类胡萝卜素裂解双加氧酶编码基因的筛选鉴定及应用制造技术

本发明专利技术属于基因工程技术领域，涉及与挥发性成分形成密切相关的类胡萝卜素裂解双加氧酶LjCCD1b及其编码基因与功能。本发明专利技术公开了类胡萝卜素裂解双加氧酶LjCCD1b基因的开放阅读框序列以及其编码的氨基酸序列。基于金银花基因组和转录组数据，本发明专利技术筛选获得LjCCD1b基因，通过构建pET32a-LjCCD1b原核表达载体，以β-胡萝卜素、10

【技术实现步骤摘要】
一种参与挥发性成分形成的类胡萝卜素裂解双加氧酶编码基因的筛选鉴定及应用


[0001]本专利技术属于植物基因工程
，具体涉及一种参与挥发性成分形成的类胡萝卜素裂解双加氧酶基因的筛选、功能验证方法及应用。

技术介绍

[0002]植物释放的挥发性有机化合物主要包括萜类、苯/苯丙烷类和脂肪酸衍生物，这些低分子量的有机物在植物-植物、植物-昆虫乃至与周边环境的相互作用过程中发挥极其重要的作用。类胡萝卜素类化合物的裂解和植物萜类挥发性成分的形成具有密切联系。研究显示，植物CCD1家族参与类胡萝卜素类化合物的裂解，所产生的挥发性C13降碳倍半萜及其衍生物(norisoprenoids)在植物香气和风味物质的形成方面起着重要作用。例如：葡萄的VvCCD1被证明参与其果实中挥发性物质的形成；ZmCCD1参与玉米果实中挥发性物质的形成；SlCCD1a和SlCCD1b与番茄的香气成分形成密切相关。
[0003]金银花为忍冬科植物干燥花蕾或带初开的花，是一种传统的中药材，可用于治疗发热、流感等。金银花一年之内多次开花，香气浓厚，也被作为园艺植物栽培，其挥发性成分主要是醇、醛、萜、酮、酯类物质，例如β-紫罗兰酮、(E，E)-2，4-壬二烯醛、(E，E)-2，4-癸二烯醛、(E)-2-壬烯醛、1-辛烯-3-醇、香叶醇、香茅醇、芳樟醇、(E)-2-己烯醛、香叶基丙酮、正己醛、苯乙醛、正辛醇等。因此，通过揭示金银花中β-紫罗兰酮等挥发性成分形成的内在分子机制，为金银花的花香调控及分子育种等奠定基础。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的在于提供参与挥发性成分形成的类胡萝卜素裂解双加氧酶编码基因及其编码的蛋白质。
[0005]本专利技术的第二个目的在于提供一种金银花中类胡萝卜素裂解双加氧酶关键基因的筛选方法。
[0006]本专利技术的第三个目的在于提供对上述筛选出的关键酶基因LjCCD1b进行功能验证的方法。
[0007]本专利技术提供的LjCCD1b基因，其核苷酸序列为SEQ ID No.1所示，或其突变序列。
[0008]本专利技术提供的LjCCD1b基因编码的蛋白质，其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。
[0009]本专利技术目的可通过如下技术方案实现，技术方案一：基于金银花基因组及转录组筛选类胡萝卜素裂解双加氧酶关键基因，步骤如下：
[0010]1)基于金银花基因组分析鉴定金银花中所有CCD基因，构建进化树分析金银花CCD与其他物种CCD之间的进化关系。
[0011]2)基于金银花不同发育时期花器官的转录组数据分析CCD基因的差异表达，进一步筛选参与金银花挥发性成分形成的类胡萝卜素裂解双加氧酶基因。
[0012]技术方案二：参与金银花挥发性成分形成的关键酶LjCCD1b的功能验证。采用大肠
杆菌原核表达体系，以β-胡萝卜素、10
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Apo-β-胡萝卜素醛及叶黄素为底物，体外鉴定金银花类胡萝卜素裂解双加氧酶LjCCD1b的功能。
[0013]本专利技术公开了金银花类胡萝卜素裂解双加氧酶LjCCD1b筛选及功能鉴定方法，LjCCD1b具有催化β-胡萝卜素和10
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Apo-β-胡萝卜素醛生成β-紫罗兰酮；催化叶黄素生成3-羟基-β-紫罗兰酮、3-羟基-α-紫罗兰酮的功能。揭示了金银花中挥发性成分形成的内在分子机制，为金银花的香气成分调控及分子育种等奠定基础。
附图说明
[0014]图1：LjCCD1b编码基因在金银花不同发育时期花器官中的差异表达，JB、GB、WB、SF、GF和GWF分别代表金银花的幼蕾期、绿蕾期、大白期、银花期、金花期和枯萎期。
[0015]图2：气相质谱联用鉴定LjCCD1b催化产物：A，催化β-胡萝卜素生成β-紫罗兰酮；B，催化10
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Apo-β-胡萝卜素醛生成β-紫罗兰酮；C和D，催化叶黄素分别生成3-羟基-α-紫罗兰酮、3-羟基-β-紫罗兰酮。
[0016]图3：金银花LjCCD1b蛋白催化机制。LjCCD1b催化β-胡萝卜素和10
′-
Apo-β-胡萝卜素醛生成β-紫罗兰酮；催化叶黄素生成3-羟基-β-紫罗兰酮、3-羟基-α-紫罗兰酮。
具体实施方案
[0017]以下结合实例详细说明本专利技术。实施是为更好的理解本专利技术，但不限定于本专利技术。以下实施方法中的实验方法均为常规方法，所涉及的实验试剂均为常规生化试剂。
[0018]实施例1基于金银花基因组与转录组数据LjCCD1b基因的筛选及系统进化分析
[0019]1.1实验方法
[0020]基于金银花基因组数据，从TAIR数据库中提取拟南芥CCD蛋白序列，通过BLASTP方法鉴定金银花的LjCCDs。蛋白序列经MUSCLE比对，构建ML系统进化树，bootstrap选择重复1000次。利用HiSAT2将金银花6个不同发育时期花器官的RNA-Seq转录组数据比对至金银花基因组，采用Cufflinks计算基因表达FPKM值。
[0021]1.2结果与分析
[0022]从金银花基因组中共筛选出了7个CCD基因，主要分布于4个亚家族，其中包括3个LjCCD1s、1个LjCCD4、1个LjCCD7和2个LjCCD8s。进一步的转录组数据分析结果显示LjCCD1b基因在金银花的幼蕾期、绿蕾期、大白期、银花期、金花期、枯萎期表达稳定，如图1。因此，推测其为参与金银花香气形成的关键酶基因。
[0023]实施例2金银花LjCCD1b功能验证方法
[0024]2.1实验方法
[0025]将LjCCD1b基因通过KpnI和EcoRI酶切位点克隆至pET32a表达载体中构建pET32a-LjCCD1b原核表达载体，进一步将载体转化至BL21(DE3)菌株中。菌液在37℃和200rpm条件下培养过夜；转接过夜培养的菌液2mL至50mL LB液体培养基中(其中含有50μg/mL氨苄青霉素)，37℃、200rpm条件下培养2-3h，菌液OD600至0.4-0.5；加入终浓度0.3mM的IPTG，16℃、130rpm条件下诱导24h；离心取菌体沉淀，加入10mM磷酸缓冲盐溶液，超声破碎得粗酶液。
[0026]分别以β-胡萝卜素、10
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Apo-β-胡萝卜素醛和叶黄素为催化底物，粗酶液在体外按照以下反应体系进行功能验证(200μL)：100mM Hepes(pH 8.0)、100μL粗酶液、1mM Fe
2+
、
100μM的β-胡萝卜素(10
′-
Apo-β-胡萝卜素醛或叶黄素)。反应液于30℃下反应3h后，利用SPME(65μm PDMS/DVB，Supelco，USA)小柱进行固相微萃取，提取反应所产生的挥发性成分。
[0027]实施例3气相-质谱联用鉴定LjCCD1b催化产物
[0028]3.1实验方法
[0029]利用Agilent Technologies 7890本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种参与挥发性成分形成的类胡萝卜素裂解双加氧酶LjCCD1b编码基因，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。2.根据权利要求1所述的类胡萝卜素裂解双加氧酶LjCCD1b，其特征在于，所述LjCCD1b蛋白质的氨基酸残基序列如SEQ ID No.2所示。3.具有SEQ ID No.2所示氨基酸序列经过替换、缺失或添加一个或多...

【专利技术属性】
技术研发人员：宋经元，浦香东，徐志超，
申请(专利权)人：中国医学科学院药用植物研究所，
类型：发明
国别省市：