一种基因重组蛋白Tat-hMsrA的高纯度纯化方法技术

本发明专利技术公开了一种基因重组蛋白Tat

【技术实现步骤摘要】
一种基因重组蛋白Tat
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hMsrA的高纯度纯化方法


[0001]本专利技术属于生物芯片制造领域，具体涉及一种基因重组蛋白Tat
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hMsrA的高纯度纯化方法。

技术介绍

[0002]蛋氨酸亚砜还原酶A是继超氧化物歧化酶之后的另一种引起广泛关注的抗氧化酶。与超氧化物歧化酶相比，蛋氨酸亚砜还原酶A不仅有在细胞内发挥清除氧化因素的作用，还可以对受损蛋白质进行有效修复。蛋氨酸亚砜还原酶A(MrsA)是一种很强的抗氧化酶。细胞穿透肽Tat安全无毒，可穿透细胞、血脑屏障，两者结合获得的人源性重组蛋白Tat
‑
hMrsA可有望用于化妆品、保健品和药品中。
[0003]论文“蛋氨酸亚砜还原酶A对线粒体氧化应激损伤的保护作用及基因重组Tat
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hMsrA中试工艺研究”中指出：使用基因工程的方法构建pet32a
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Tat
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hMsrA质粒，并从BL21(DE3)、gammi、rosseta、gold筛选最合适的大肠杆菌宿主菌BL21(DE3)，然后进行蛋白的异丙基
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β
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D
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硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达，发现目标蛋白主要在包涵体表达，需要进行目标蛋白的变形和复性。但是从包涵体得到纯化目标蛋白，检测后无活性。
[0004]公开号为CN110283798A，专利技术名称为一种基因重组蛋白Tat
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hMsrA的纯化方法的中国专利技术专利公开了一种基因重组蛋白Tat
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hMsrA的纯化方法。该纯化方法能够有效确保纯化的蛋白具有活性。但是整体来说，其收率、纯度和蛋白活性均不甚理想。从其电泳图可以看出，纯化后的蛋白中明显含有杂质蛋白，而且纯化后的蛋白活性也不高。

技术实现思路

[0005]本专利技术针对现有技术中存在的至少一种技术问题，提供一种基因重组蛋白Tat
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hMsrA的高纯度纯化方法，本专利技术操作步骤简单，获得的目标蛋白纯度高，活性高，而且收率也较高。
[0006]本专利技术解决上述技术问题的技术方案如下：一种基因重组蛋白Tat
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hMsrA的高纯度纯化方法，包括以下步骤：
[0007]S1，获取表达融合蛋白Trx
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Tat
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hMsrA的枯草芽孢杆菌菌液；
[0008]S2，将所述枯草芽孢杆菌菌液重悬，加入RIPA裂解液，4℃以下温度下裂解，离心，弃上清后得沉淀；
[0009]S3，将所述沉淀用PBS漂洗，而后重悬于RIPA裂解液中，再次在4℃以下温度下裂解，得裂解混合液；
[0010]S4，将所述裂解混合液离心，弃上清，而后向蛋白沉淀中加入肠激酶酶切缓冲液酶切，得酶切后的混合溶液；
[0011]S5，将向所述混合溶液中加入复性溶液，复性，得复性混合物；
[0012]S6，将所述复性混合物先经纳滤除去杂质，而后经离子交换层析柱层析纯化，收集目标蛋白Tat
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hMsrA，即得。
[0013]在上述技术方案的基础上，本专利技术还可以做如下改进。
[0014]进一步，所述步骤S2和步骤S3中，4℃以下温度下裂解采用冰上裂解的方式完成。
[0015]进一步，所述步骤S2中，裂解时间控制在15min。
[0016]进一步，所述步骤S3中，PBS漂洗3～5次。
[0017]进一步，所述步骤S3中，裂解时间控制在15～20min。
[0018]进一步，所述步骤S2和S4中，所述离心操作温度控制在4℃，以12000rpm离心。
[0019]进一步，所述步骤S2和S4中，所述离心时间控制在15～20min。
[0020]进一步，所述步骤S5中，所述复性所采用的复性溶液为含0.7～1.0mg/mL溶菌酶、1.0～2.0mg/L谷氨酰胺和0.1～0.5mol/L氯化锌的磷酸缓冲液。
[0021]进一步，所述步骤S6中，所述纳滤采用水凝胶
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纳米颗粒滤膜，膜孔径为0.45μm。
[0022]进一步，所述步骤S6中，所述离子交换柱层析采用交联葡聚糖凝胶柱，并依次采用0.12mol/L、0.18mol/L、0.38mol/L、0.54mol/L、0.76mol/L的氯化钠溶液进行梯度洗脱，收集目标洗脱峰。
[0023]本专利技术的有益效果是：本专利技术采用裂解液裂解，配合纳滤法除杂后，再以离子交换层析的方式分离纯化基因重组蛋白Tat
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hMsrA，获得的目标蛋白纯度高，纯度可以达到99.2％以上，活性也较佳，整个工艺过程基本没有目标蛋白的损失，整体收率较佳。
附图说明
[0024]图1是本专利技术实施例2的工艺制备出的基因重组蛋白Tat
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hMsrA的SDS
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PAGE图。
具体实施方式
[0025]以下结合附图对本专利技术的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本专利技术，并非用于限定本专利技术的范围。
[0026]本专利技术设计的一种基因重组蛋白Tat
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hMsrA的高纯度纯化方法，包括以下步骤：
[0027]S1，获取表达融合蛋白Trx
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Tat
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hMsrA的枯草芽孢杆菌菌液；
[0028]S2，将所述枯草芽孢杆菌菌液重悬，加入RIPA裂解液，4℃以下温度下裂解，离心，弃上清后得沉淀；
[0029]S3，将所述沉淀用PBS漂洗，而后重悬于RIPA裂解液中，再次在4℃以下温度下裂解，得裂解混合液；
[0030]S4，将所述裂解混合液离心，弃上清，而后向蛋白沉淀中加入肠激酶酶切缓冲液酶切，得酶切后的混合溶液；
[0031]S5，将向所述混合溶液中加入复性溶液，复性，得复性混合物；
[0032]S6，将所述复性混合物先经纳滤除去杂质，而后经离子交换层析柱层析纯化，收集目标蛋白Tat
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hMsrA，即得。
[0033]本专利技术的核心在于采用裂解液裂解细胞，并且严格控制了细胞的裂解温度，通过多次裂解配合漂洗过程，有效在破碎环节去除了培养基杂质，由于全程未采用超声或机械破碎，而目标蛋白在低温条件下在RIPA裂解液中并不发生损坏，所得目标蛋白的活性极佳；而且本专利技术采用先纳滤法去除试剂及杂质，获得纯蛋白后再采用离子交换层析法分离出目标蛋白Tat
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hMsrA，有效保证了离子交换层析的条件，能够获得纯度极佳的目标蛋白。本发
明的技术效果是依赖上述技术特征协同获得的。
[0034]本专利技术还提供了改进的技术方案，在改进的技术方案中，所述步骤S2和步骤S3中，4℃以下温度下裂解采用冰上裂解的方式完成。
[0035]本专利技术还提供了改进的技术方案，在改进的技术方案中，所述步骤S2中，裂解时间控制在15min。
[0036]本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基因重组蛋白Tat
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hMsrA的高纯度纯化方法，其特征在于包括以下步骤：S1，获取表达融合蛋白Trx
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Tat
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hMsrA的枯草芽孢杆菌菌液；S2，将所述枯草芽孢杆菌菌液重悬，加入RIPA裂解液，4℃以下温度下裂解，离心，弃上清后得沉淀；S3，将所述沉淀用PBS漂洗，而后重悬于RIPA裂解液中，再次在4℃以下温度下裂解，得裂解混合液；S4，将所述裂解混合液离心，弃上清，而后向蛋白沉淀中加入肠激酶酶切缓冲液酶切，得酶切后的混合溶液；S5，将向所述混合溶液中加入复性溶液，复性，得复性混合物；S6，将所述复性混合物先经纳滤除去杂质，而后经离子交换层析柱层析纯化，收集目标蛋白Tat
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hMsrA，即得。2.根据权利要求1所述的一种基因重组蛋白Tat
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hMsrA的高纯度纯化方法，其特征在于，所述步骤S2和步骤S3中，4℃以下温度下裂解采用冰上裂解的方式完成。3.根据权利要求1所述的一种基因重组蛋白Tat
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hMsrA的高纯度纯化方法，其特征在于，所述步骤S2中，裂解时间控制在15min。4.根据权利要求1所述的一种基因重组蛋白Tat
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hMsrA的高纯度纯化方法，其特征在于，所述步骤S3中，PBS漂洗3～5次。5.根据权利要求1所述的一种基因重组蛋白Tat
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【专利技术属性】
技术研发人员：曾建华，闫云云，胡雪平，
申请(专利权)人：嘉兴玖肽生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：