一种用于制备丹参酮类化合物的丹参P450突变体制造技术

本发明专利技术公开了一种用于制备丹参酮类化合物的丹参P450突变体。本发明专利技术通过定向改造CYP76AH3，对其催化效率进行优化，使原本需要CYP76AH1与CYP76AH3两个蛋白协同作用完成的反应路径通过本发明专利技术中的CYP76AH3突变体可以直接催化完成，CYP76AH3突变体的构建可以缩短反应过程中底物运输路径，在一个蛋白口袋内高效完成多步反应，从而提高底物利用效率，提高目标化合物的产量。本发明专利技术中针对不同产物转化效率提高的CYP76AH3突变体为后续丹参酮生物合成途径解析提供底物及底盘菌，对丹参酮生物合成途径全解析及构建高产丹参酮类化合物酵母工程菌具有重要指导意义。母工程菌具有重要指导意义。

【技术实现步骤摘要】
一种用于制备丹参酮类化合物的丹参P450突变体


[0001]本专利技术涉及一种用于制备丹参酮类化合物的丹参P450突变体。

技术介绍

[0002]在药用天然产物的生物催化和合成生物学研究中，P450的催化效率一直是国际合成生物学研究中的难点问题。例如，青蒿酸的合成生物学中存在P450的催化效率对终产物的产量限制的问题，在CYP71AV1和CPR1表达后，青蒿酸生产工程酵母Y285培养产物的产量较上一步紫穗槐二烯的产量显着降低。Paddon等认为，Y285中倍半萜产物的催化活性降低和产量减少可能是由催化氧化紫穗槐二烯的细胞色素P450的效率过低引起的。
[0003]丹参酮类化合物生物合成途径中含有多个P450，申请人所在实验室结合组学技术、生物信息学和合成生物学手段克隆并验证了P450酶CYP76AH1和CYP76AH3的功能(图1)。由于P450催化功能的杂泛性，导致丹参酮类化合物生物合成途径分成两个分支，产生了分别在铁锈醇和柳杉酚的基础上进行了7位和11位修饰的两类化合物。在通过P450酶直接催化和通过含有野生型CYP76AH1、CYP76AH3基因的酵母工程菌株获取丹参酮类前体化合物的实验中，P450的催化效率一直是亟待解决的重要难题，CYP76AH1、CYP76AH3两个P450是丹参酮类化合物生物合成研究的关键组件和限速步骤。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的是提供一种用于制备丹参酮类化合物的丹参P450突变体。
[0005]第一方面，本专利技术首先保护蛋白质，是将序列表中序列4所示的蛋白质第301位氨基酸残基、第306位氨基酸残基、第395位氨基酸残基和第479位氨基酸残基中的至少一个进行突变得到的。
[0006]所述蛋白质为如下(a1)-(a15)中的任一种：
[0007](a1)将序列表中序列4所示的蛋白质进行如下点突变得到的蛋白质：第301位氨基酸残基由E突变为D，第306位氨基酸残基由E突变为S；
[0008](a2)将序列表中序列4所示的蛋白质进行如下点突变得到的蛋白质：第301位氨基酸残基由E突变为D，第479位氨基酸残基由F突变为V；
[0009](a3)将序列表中序列4所示的蛋白质进行如下点突变得到的蛋白质：第301位氨基酸残基由E突变为D，第395位氨基酸残基由M突变为I；
[0010](a4)将序列表中序列4所示的蛋白质进行如下点突变得到的蛋白质：第395位氨基酸残基由M突变为I；
[0011](a5)将序列表中序列4所示的蛋白质进行如下点突变得到的蛋白质：第306位氨基酸残基由E突变为S，第395位氨基酸残基由M突变为I；
[0012](a6)将序列表中序列4所示的蛋白质进行如下点突变得到的蛋白质：第306位氨基酸残基由E突变为S；
[0013](a7)将序列表中序列4所示的蛋白质进行如下点突变得到的蛋白质：第301位氨基
酸残基由E突变为D；
[0014](a8)将序列表中序列4所示的蛋白质进行如下点突变得到的蛋白质：第301位氨基酸残基由E突变为D，第306位氨基酸残基由E突变为S，第395位氨基酸残基由M突变为I；
[0015](a9)将序列表中序列4所示的蛋白质进行如下点突变得到的蛋白质：第395位氨基酸残基由M突变为I，第479位氨基酸残基由F突变为V；
[0016](a10)将序列表中序列4所示的蛋白质进行如下点突变得到的蛋白质：第301位氨基酸残基由E突变为D，第395位氨基酸残基由M突变为I，第479位氨基酸残基由F突变为V；
[0017](a11)将序列表中序列4所示的蛋白质进行如下点突变得到的蛋白质：第306位氨基酸残基由E突变为S，第395位氨基酸残基由M突变为I，第479位氨基酸残基由F突变为V；
[0018](a12)将序列表中序列4所示的蛋白质进行如下点突变得到的蛋白质：第301位氨基酸残基由E突变为D，第306位氨基酸残基由E突变为S，第395位氨基酸残基由M突变为I，第479位氨基酸残基由F突变为V；
[0019](a13)将序列表中序列4所示的蛋白质进行如下点突变得到的蛋白质：第301位氨基酸残基由E突变为D，第306位氨基酸残基由E突变为S，第479位氨基酸残基由F突变为V；
[0020](a14)将序列表中序列4所示的蛋白质进行如下点突变得到的蛋白质：第306位氨基酸残基由E突变为S，第479位氨基酸残基由F突变为V；
[0021](a15)将序列表中序列4所示的蛋白质进行如下点突变得到的蛋白质：第479位氨基酸残基由F突变为V。
[0022]本专利技术还保护编码以上任一所述的蛋白质的基因。
[0023]所述基因具体可为如下(A1)-(A15)中的任一种：
[0024](A1)将序列3自5
’
端第903位g突变为c，第916位g突变为t，第917位a突变为c得到的DNA分子；
[0025](A2)将序列3自5
’
端第903位g突变为c，第1435位t突变为g，第1437位c突变为g得到的DNA分子；
[0026](A3)将序列3自5
’
端第903位g突变为c，第1185位g突变为a得到的DNA分子；
[0027](A4)将序列3自5
’
端第1185位g突变为a得到的DNA分子；
[0028](A5)将序列3自5
’
端第916位g突变为t，第917位a突变为c，第1185位g突变为a得到的DNA分子；
[0029](A6)将序列3自5
’
端第916位g突变为t，第917位a突变为c得到的DNA分子；
[0030](A7)将序列3自5
’
端第903位g突变为c得到的DNA分子；
[0031](A8)将序列3自5
’
端第903位g突变为c，第916位g突变为t，第917位a突变为c，第1185位g突变为a得到的DNA分子；
[0032](A9)将序列3自5
’
端第1185位g突变为a，第1435位t突变为g，第1437位c突变为g得到的DNA分子；
[0033](A10)将序列3自5
’
端第903位g突变为c，第1185位g突变为a，第1435位t突变为g，第1437位c突变为g得到的DNA分子；
[0034](A11)将序列3自5
’
端第916位g突变为t，第917位a突变为c，第1185位g突变为a，第1435位t突变为g，第1437位c突变为g得到的DNA分子；
[0035](A12)将序列3自5
’
端第903位g突变为c，第916位g突变为t，第917位a突变为c，第
1185位g突变为a，第1435位t突变为g，第1437位c突变为g得到的DNA分子；
[0036](A13)将序本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.蛋白质，是将序列表中序列4所示的蛋白质第301位氨基酸残基、第306位氨基酸残基、第395位氨基酸残基和第479位氨基酸残基中的至少一个进行突变得到的。2.如权利要求1所述的蛋白质，其特征在于：所述蛋白质为如下(a1)-(a15)中的任一种：(a1)将序列表中序列4所示的蛋白质进行如下点突变得到的蛋白质：第301位氨基酸残基由E突变为D，第306位氨基酸残基由E突变为S；(a2)将序列表中序列4所示的蛋白质进行如下点突变得到的蛋白质：第301位氨基酸残基由E突变为D，第479位氨基酸残基由F突变为V；(a3)将序列表中序列4所示的蛋白质进行如下点突变得到的蛋白质：第301位氨基酸残基由E突变为D，第395位氨基酸残基由M突变为I；(a4)将序列表中序列4所示的蛋白质进行如下点突变得到的蛋白质：第395位氨基酸残基由M突变为I；(a5)将序列表中序列4所示的蛋白质进行如下点突变得到的蛋白质：第306位氨基酸残基由E突变为S，第395位氨基酸残基由M突变为I；(a6)将序列表中序列4所示的蛋白质进行如下点突变得到的蛋白质：第306位氨基酸残基由E突变为S；(a7)将序列表中序列4所示的蛋白质进行如下点突变得到的蛋白质：第301位氨基酸残基由E突变为D；(a8)将序列表中序列4所示的蛋白质进行如下点突变得到的蛋白质：第301位氨基酸残基由E突变为D，第306位氨基酸残基由E突变为S，第395位氨基酸残基由M突变为I；(a9)将序列表中序列4所示的蛋白质进行如下点突变得到的蛋白质：第395位氨基酸残基由M突变为I，第479位氨基酸残基由F突变为V；(a10)将序列表中序列4所示的蛋白质进行如下点突变得到的蛋白质：第301位氨基酸残基由E突变为D，第395位氨基酸残基由M突变为I，第479位氨基酸残基由F突变为V；(a11)将序列表中序列4所示的蛋白质进行如下点突变得到的蛋白质：第306位氨基酸残基由E突变为S，第395位氨基酸残基由M突变为I，第479位氨基酸残基由F突变为V；(a12)将序列表中序列4所示的蛋白质进行如下点突变得到的蛋白质：第301位氨基酸残基由E突变为D，第306位氨基酸残基由E突变为S，第395位氨基酸残基由M突变为I，第479位氨基酸残基由F突变为V；(a13)将序列表中序列4所示的蛋白质进行如下点突变得到的蛋白质：第301位氨基酸残基由E突变为D，第306位氨基酸残基由E突变为S，第479位氨基酸残基由F突变为V；(a14)将序列表中序列4所示的蛋白质进行如下点突变得到的蛋白质：第306位氨基酸残基由E突变为S，第479位氨基酸残基由F突变为V；(a15)将序列表中序列4所示的蛋白质进行如下点突变得到的蛋白质：第479位氨基酸残基由F突变为V。3.编码权利要求1或2所述的蛋白质的基因。4.含有权利要求3所述基因的重组表达载体、表达盒或重组菌。5.权利...

【专利技术属性】
技术研发人员：郭娟，毛亚平，马莹，曾雯，陈同，黄璐琦，
申请(专利权)人：中国中医科学院中药研究所，
类型：发明
国别省市：