一种来源亚洲象肠道宏基因组的细菌漆酶及其基因制造技术

本发明专利技术公开了一种来源亚洲象肠道宏基因组的细菌漆酶及其基因，该细菌漆酶的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示，编码基因如SEQIDNO.2所示，利用宏基因组分箱技术组装获得一株完整度为99.73％且污染率为0的未培养Paludibacteraceae菌科UBA1181菌属细菌的基因组，经InterPro和Pfam数据库注释含多铜多酚氧化还原酶漆酶基因，通过基因工程技术制备得到细菌漆酶Lacc1。该该细菌漆酶与真菌来源的漆酶相比，具有良好的热稳定性和pH稳定性。具有良好的热稳定性和pH稳定性。

【技术实现步骤摘要】
一种来源亚洲象肠道宏基因组的细菌漆酶及其基因


[0001]本专利技术属于酶基因工程
，涉及一种来源亚洲象肠道宏基因组的细菌漆酶及其基因，通过宏基因组测序分析技术和分子生物学手段获得表达该新型漆酶的重组表达菌株。

技术介绍

[0002]漆酶(EC 1.10.3.2)属于多铜氧化酶类，其能够催化多种类型的酚类及非酚类化合物的氧化，并且以分子氧作为电子受体，最终生成水，不会生成其他有害的副产物，是一类绿色、环保、环境友好的生物催化剂。漆酶已经广泛应用在制浆造纸、药物合成、污水处理、食品能源等领域。
[0003]漆酶分布广泛，目前在细菌、真菌和动植物等体内都被发现过。对比动植物来源漆酶，微生物漆酶来源更加丰富。但是，真菌来源漆酶在工业生产中遇到极端环境如高温和碱性条件下其活性很难保持，其应用受限。细菌来源漆酶底物广泛、pH稳定性和热稳定性强、以及耐受碱性环境等特点引起了研究人员的普遍关注。
[0004]细菌漆酶基因的获得、克隆和表达，首先要通过传统的微生物纯培养技术进行菌株的分离和纯化，但99％以上的不可培养微生物是无法分离获得的，尤其是肠道环境的厌氧微生物可培养性更低，因此通过分离培养细菌筛选新型漆酶的传统方法限制了筛选的广泛性和有效性。宏基因组学结合高通测序技术避开了微生物分离培养问题，能在短时间内发现大量功能酶基因，提高了酶功能基因的克隆效率，为寻找和发现新的漆酶基因提供了新的研究策略。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的在于克服和避免漆酶在工业生产中不足，并提供一种来源于亚洲象肠道宏基因组细菌的新型漆酶编码基因及表达该新型细菌漆酶基因的工程菌株。
[0006]本专利技术中，新型漆酶的编码基因来源于亚洲象肠道宏基因组，经分箱技术组装获得一株完整度为99.73％且污染率为0的未培养Paludibacteraceae菌科UBA1181菌属细菌的基因组，经InterPro和Pfam数据库注释含多铜多酚氧化还原酶漆酶基因(IPR003730和PF02578.16)，对该新型漆酶编码基因进行克隆，并在大肠杆菌表达系统进行表达，获得了大肠杆菌高稳定性漆酶重组菌株。
[0007]为了达到上述技术目的，本专利技术具体通过以下技术方案实现：
[0008]一种来源亚洲象肠道宏基因组的细菌漆酶Lacc1，所述细菌漆酶Lacc1的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
[0009]所述细菌漆酶Lacc1以底物2,2
’‑
联氮
‑
二(3
‑
乙基
‑
苯并噻唑
‑6‑
磺酸)二铵盐(ABTS)测定新型漆酶Lacc1酶学性质时，最佳作用温度为75℃，最适作用pH为5.5。
[0010]以底物ABTS测定该新型漆酶Lacc1的pH稳定性和热稳定性，结果显示：在70℃下，pH 5～6范围内具有良好稳定性，作为鲜有报道的亚洲象肠道宏基因组来源的新型漆酶
Lacc1，与真菌来源的漆酶相比，其pH稳定性和温度稳定性更好。
[0011]所述细菌漆酶的编码基因lacc1也在本专利技术的保护范围制备，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
[0012]在本专利技术的另一方面，将本专利技术的细菌漆酶编码基因lacc1插入到表达载体中，使其核苷酸序列与表达调控序列相连接。提供了一种包含所述细菌漆酶基因lacc1的重组载体。
[0013]作为本专利技术的一个优选的实施方案，将本专利技术的细菌漆酶编码基因lacc1和表达载体pET28a(+)相连接，得到重组大肠杆菌表达质粒pET28a
‑
laac1。
[0014]更优选的，用于表达所述细菌漆酶Lacc1的宿主细胞为E.coli DH5α。
[0015]在本专利技术的另一方面，还提供了一种包含所述细菌漆酶编码基因lacc1的重组菌株。
[0016]优选的所述重组菌株为大肠杆菌，更优选的为重组菌株E.coli BL21(DE3)/pET28a
‑
Lacc1。
[0017]在本专利技术的另一方面，提供了上述新型细菌漆酶Lacc1的制备方法，包括以下步骤：
[0018]1)以亚洲象肠道宏基因组DNA为模板，并根据宏基因组分析获得的与NR数据库漆酶比对最高仅有45％一致性的未培养细菌漆酶基因，分析其保守序列，设计本专利技术的漆酶基因的扩增引物P1和P2，通过PCR扩增获得目的漆酶编码基因lacc1；
[0019]2)漆酶编码基因lacc1和表达载体pET28a(+)经EcoRI和HindIII双酶切，T4连接酶连接后转化至克隆宿主E.coli DH5α，经验证正确后，从而获得重组质粒；
[0020]3)将获得的重组质粒转化至宿主大肠杆菌BL21(DE3)并成功表达，获得产高稳定性新型漆酶Lacc1的重组菌株；
[0021]4)通过发酵工艺优化获得高产高稳定性新型漆酶Lacc1。
[0022]其中，
[0023]上游引物P1：CAATTCATGATCGCTGATCGAAGAACG；
[0024]下游引物P2：AAGCTTTTAATAATTGCATATTCC。
[0025]在本专利技术的另一方面，提供了所述细菌漆酶Lacc1在孔雀石绿和结晶紫废水脱色中的应用。
[0026]在漆酶Lacc1最适反应条件下，对孔雀石绿和结晶紫模拟废水分别脱色35min，脱色率分别达到59.5％和54.5％。
[0027]本专利技术的有益效果为：
[0028]本专利技术通过宏基因组分箱技术组装获得一株完整度为99.73％且污染率为0的未培养Paludibacteraceae菌科UBA1181菌属细菌的基因组，经InterPro和Pfam数据库注释含多铜多酚氧化还原酶漆酶基因，通过基因工程技术制备得到细菌漆酶Lacc1。该细菌漆酶Lacc1与真菌来源的漆酶相比，在70℃下，pH 5～6范围内具有良好稳定性，其pH稳定性和温度稳定性更好。
附图说明
[0029]图1是本专利技术新型漆酶编码基因的PCR扩增琼脂糖凝胶电泳图；
[0030]图2是本专利技术重组质粒pET28a
‑
lacc1酶切琼脂糖凝胶电泳图；
[0031]图3是本专利技术新型漆酶Lacc1最适作用温度曲线；
[0032]图4是本专利技术新型漆酶Lacc1最适作用pH曲线；
[0033]图5是本专利技术新型漆酶Lacc1对孔雀石绿和结晶紫染料废水的脱色率。
具体实施方式
[0034]下面将结合本专利技术具体的实施例，对本专利技术技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。
[0035]本专利技术所使用的亚洲象肠道宏基因组测序原始数据己存入中国科学院大数据中心基因组序列档案库，登录号为CRA003369。...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种来源亚洲象肠道宏基因组的细菌漆酶，其特征在于，所述细菌漆酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。2.权利要求1所述细菌漆酶的编码基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。3.一种重组质粒，其特征在于，包含权利要求2所述编码基因。4.一种重组菌，其特征在于，包含权利要求2所述编码基因。5.权利要求1所述细菌漆酶的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：1)以亚洲象肠道宏基因组DNA为模板，并根据宏基因组分析获得的与NR数据库漆酶比对最高仅有45％一致性的未培养细菌漆酶基因，分析其保守序列，设计本发明的漆酶基因的扩增引物P1和P2，...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄遵锡，张呈波，苗华彪，吴倩，
申请(专利权)人：云南师范大学，
类型：发明
国别省市：