一种基于自动化移液工作站进行脂溶性维生素检测样本前处理的方法技术

本发明专利技术提供一种基于自动化移液工作站进行脂溶性维生素检测样本前处理的方法，所述方法主要用于高效液相色谱串联质谱检测样本中脂溶性维生素，通过对自动移液工作站的全新应用，选择了合适的操作模式和程序参数，实现了脂溶性维生素样本液液萃取的高通量、自动化和低成本，解决了液液萃取需大量的人工操作的难题，可完美替代适于高通量检测的成本昂贵的SLE板提取方法；并采用异辛烷和异丙醇的混合物作为萃取剂，异丙醇为溶解溶液，甲醇和水为复溶剂，同时进一步优化比例关系，明显提高样本中的维生素K1的回收率，使后续的高效液相色谱串联质谱检测结果更加准确，灵敏度更高，使得对样本中K1的检测能力满足临床的参考区间的实际需求。的实际需求。的实际需求。

【技术实现步骤摘要】
一种基于自动化移液工作站进行脂溶性维生素检测样本前处理的方法


[0001]本专利技术属于维生素的检测领域，具体而言，涉及一种用于脂溶性维生素检测的样本前处理方法，尤其涉及一种通过自动化移液工作站对需要脂溶性维生素检测的血清样本进行前处理方法。

技术介绍

[0002]脂溶性维生素对人体健康、尤其是对儿童的生长发育具有重要的作用，维生素A缺乏可导致干眼症、夜盲症，研究表明维生素A水平与癌症风险存在明显的相关性；维生素D的主要生理作用是维持钙和磷的平衡，从而促进骨骼健康。此外，研究表明维生素D的水平对于免疫系统功能和多种疾病的发病存在明显的相关，如肺结核的发生、心脏病和内分泌疾病。维生素E也叫生育酚，主要发挥抗氧化功能，可清除体内的自由基。维生素E与肝脏疾病和心血管疾病的风险存在相关性。维生素K在血液凝血过程中起重要的作用，体内有两种天然形式(维生素K1和维生素K2)，临床测定主要检测维生素K1。
[0003]现有的ADEK样本前处理方法主要是采用液液提取和固液萃取方法：
[0004](1)液液提取方法通过加入小极性的有机提取溶剂到血液样本中，通过“涡旋振荡”混匀的方式，萃取得到脂溶性维生素，其显著缺点是检测通量低，效率低，前处理过程需大量的人工操作，难以转换为96孔板高通量方法，难以实现高通量和自动化，限制了其在临床应用和推广。CN106504947A提供了一种半自动样本处理液相色谱技术测定脂溶性维生素的方法，通过采用半自动液液萃取仪采用传统的涡旋振荡混匀模式来进行液液提取，因此半自动液液萃取仪同时进行萃取的通道数非常有限，且无法与96孔板实现无缝对接，给实验操作带来了很多繁琐的人工操作过程，导致操作时间随之增加并且需要大量人工，不适合大规模高通量脂溶性维生素提取工作。
[0005](2)固液萃取方法，即固相支持液液萃取方法，是基于特殊的硅藻土填料颗粒实现液液分配，富集萃取血液样本中脂溶性维生素，其优势是易于实现96孔板高通量检测，耗材有商品化产品，检测通量高，需要人工操作较少，但同时也存在耗材成本高等问题。CN110763788A公开了一种采用固相支撑液液萃取方法(SLE方法)实现液相色谱串联质谱高通量检测血浆中脂溶性维生素的方法，其样本前处理方法虽然适用于96孔板高通量检测，而且其中也提到可配合自动移液工作站来实现自动化操作，但其中样本萃取过程主要依靠SLE板来完成，自动移液工作站仅能代替人工起到移液功能，不能替代SLE板的萃取功能，同时也必然存在SLE板的高成本问题。
[0006]因此迫切需要一种能真正实现高通量和自动化操作的脂溶性维生素样本前处理方法使其可以克服现有方法的以上不足和缺陷，具有样本处理时间短，处理效率高，高通量，耗材成本低，自动化程度高，人工工作量小的优点，便于临床的推广和使用。
[0007]另一方面，由于正常人体的维生素K1含量较低，维生素K1的临床检测参考区间仅为0.13
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1.39ng/mL，因此对检测方法的样本前处理回收率和检测灵敏度要求非常高，现有
的样本前处理方法中，选用的萃取剂虽然能满足同时检测样本中的多种脂溶性维生素，但是对维生素K1的萃取回收率却偏低，导致维生素K1的检测灵敏度受限制，无法对K1是否缺乏临床上进行很准确的判断。
[0008]因此急需一种改进的脂溶性维生素样本前处理方法用于高效液相色谱串联质谱定量分析血清中的脂溶性维生素，一方面能真正实现高通量和自动化操作，实现高效便捷；另一方面还能大幅降低耗材成本；同时还能提高脂溶性维生素，尤其是维生素K1的前处理回收率，从而提高后续的高效液相色谱串联质谱检测结果灵敏度，满足临床的参考区间对血浆中维生素K1检测能力的实际需求。

技术实现思路

[0009]为解决上述问题，本专利技术提供一种通过自动化移液工作站对需要脂溶性维生素检测的样本进行前处理的方法，通过对自动化移液工作站的全新应用，并选择了合适的操作模式和程序参数，实现了过去一直难以实现的脂溶性维生素样本液液萃取的高通量、自动化和低成本，解决了液液萃取需大量的人工操作的难题，可完美替代适于高通量检测的昂贵的SLE板提取方法；同时通过选用更合适的萃取剂、稀释剂和复溶溶液，明显提高人血清中含量最低的维生素K1的回收率，使后续的高效液相色谱串联质谱检测结果更加准确，灵敏度更高，使得对血液样本中维生素K1的检测能力同时满足临床的参考区间的实际需求，可用于临床上更精确地判断人体中正常含量较低的的维生素K1是否缺乏。
[0010]现有的脂溶性维生素检测样本的高通量前处理方法，都是通过SLE板进行固液萃取，可以实现96孔板高通量检测；液液萃取难以转换为96孔板高通量方法，难以实现高通量和自动化，虽然有通过半自动液液萃取仪进行涡旋混合液液萃取，但通道数非常有限，而且操作较繁琐，而且也仍然无法与96孔板对接，因为96孔板的结构不适合大体积溶剂的涡旋混匀，96孔板的单孔一般是细长的柱状结构，内径很小，内部容积较小，当加入大体积的两种不互溶的溶剂，通过传统的“涡旋振荡”方式无法达到有效的混合提取的目的，因此不适合两种不互溶的溶剂的涡旋混匀，难以应用在脂溶性维生素检测。
[0011]自动化移液工作站通常用于代替人工进行高通量移液，其中设置有“混匀模式”，能用于使两种相互溶解的溶剂混合在一起，比如稀释、移液、加液、混匀等，因此移液工作站常规上只是作为一种辅助操作设备来使用，广泛用于沉淀蛋白、液液提取、固相萃取等样本前处理方法中。本研究小组令人惊喜地发现，通过自动化移液工作站，尤其是通过其中的“混匀模式”，也可进行两种不互溶的溶剂之间的液液提取，可顺利完成脂溶性维生素检测样本的液液萃取，再经不同运行模式及其运行参数的系列设置，能够真正实现脂溶性维生素检测样本液液萃取的高通量和自动化，使前处理过程更方便快捷高效，处理效果好，脂溶性维生素回收率高，完全可以替代高成本的SLE板。
[0012]利用自动化移液工作站的“混匀模式”进行液液提取的原理如图1所示，生物样本和提取溶剂由于密度差异和不相溶，生物样本分布在孔的下部，提取溶剂分布在上部，混匀模式通过设置移液枪头的吸液深度，吸取样本层到移液枪头内，然后调整放液深度，在单孔的上部放液，用以上方式将生物样本转移至上部，提取溶剂转移在下部，随后根据密度差异两相重新进行分布到初始状态，通过以上的循环过程，从而对两相进行高效的混匀，将生物样本中的脂溶性维生素提取到萃取溶剂中，实现了传统涡旋混匀模式在96通道处理过程中
无法实现的技术效果。
[0013]一方面，本专利技术提供了一种基于自动移液工作站的脂溶性维生素高通量检测样本的前处理方法，采用自动移液工作站的“混匀模式”对样本进行液液萃取，其中采用的萃取剂为异辛烷和异丙醇的混合物。
[0014]本专利技术提供的基于自动移液工作站进行血液基质样本前处理的方法获得的样本，可用于液相色谱质谱联用技术定量分析人血清、血浆和末梢全血中的脂溶性维生素。
[0015]所述样本前处理的方法包括样本的稀释、萃取和吹干复溶过程。
[0016本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于自动移液工作站的脂溶性维生素高通量检测样本的前处理方法，其特征在于，采用自动移液工作站的“混匀模式”对样本进行液液萃取，其中采用的萃取剂为异辛烷和异丙醇的混合物。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在样本的稀释、萃取和吹干复溶过程中，自动移液工作站都可以采用“混匀模式”；在样本的萃取过程中，自动移液工作站的“混匀模式”程序设置参数包括：混匀次数为50
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100次，混匀体积为0.3
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0.9ml；所述萃取剂中异辛烷和异丙醇的体积比为9∶1。3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，在样本的萃取过程中，自动移液工作站的“混匀模式”程序设置参数还包括：吸液速度和放液速度为80％～90％，吸液深度为90％，放液深度为50％。4.如权利要求1
‑
3任一项所述的方法，其特征在于，在样本的稀释过程中，自动移液工作站的“混匀模式”程序设置参数包括：混匀次数为10
‑
30次，混匀体积为100
‑
200ul。5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，在样本的稀释过程中，稀释溶液为0.1～1mg/mL BHT(2,6
‑
二叔丁基
‑4‑
甲基苯酚)溶液，溶解溶剂选自甲醇、乙醇、乙腈、异丙醇中的一种或多种。6.如权利要求1
‑
5任一项所述的方法，其特征在于，在样本的吹干复溶过程中，复溶溶液为甲醇和水的混合物，其中...

【专利技术属性】
技术研发人员：富士山，卫晓乐，曲亮，马金飞，刘华芬，
申请(专利权)人：杭州凯莱谱精准医疗检测技术有限公司，
类型：发明
国别省市：