特异性更强的禽坦布苏病毒检测试剂盒制造技术

本发明专利技术提供一种特异性更强的禽坦布苏病毒检测试剂盒。所述检测试剂盒包含特异性检测禽坦布苏病毒的引物ATMUV

【技术实现步骤摘要】
特异性更强的禽坦布苏病毒检测试剂盒


[0001]本专利技术属于动物病毒学领域，具体涉及一种特异性更强的禽坦布苏病毒检测试剂盒。

技术介绍

[0002]实时荧光定量PCR方法（Real
‑
time PCR）是一种在DNA扩增反应中，以荧光化学物质检测每次聚合酶链式反应（PCR）循环后产物总量的方法。实时荧光定量PCR在PCR扩增过程中，通过荧光信号，对PCR进程进行实时检测。由于在PCR扩增的指数时期，模板的Ct值和该模板的起始拷贝数存在线性关系。目前根据所使用荧光化学物质的不同，主要包括荧光染料和荧光探针两类。荧光探针是基于荧光共振能量转移(fluorescence resonance energy transfer, FRET)原理。TaqMan 探针是水解探针的代表，对目标序列有很高的特异性，同时结合引物的特异性，使得qRT
‑
PCR技术的特异性和准确性极大提高，而且反应结束后不需进行寡核苷酸熔解曲线分析，缩短了实验时间，可避免SYBR GreenⅠ实时荧光定量方法可能导致的结果误读误判。MGB TaqMan 探针是经过改进的探针，其3'端采用的是非荧光性的淬灭基团，大大降低了本底信号的干扰；尤其是该探针的3'端还连接了1 个MGB，使探针与模板的杂交更加稳定，提高探针熔解温度(melting temperature, Tm)，使较短的探针也能达到较高的Tm 值；又由于短探针的荧光基团和淬灭基团的距离较近，所以淬灭效果更好，荧光背景更低；另外短探针也节约了探针设计成本，可同时对单一样本（尤其针对样品难以获取或病原载量较低样本）开展多种病原学检测，具有高通量、成本低廉、结果迅速等优点，在新发传染病等领域被广泛使用。
[0003]禽坦布苏病毒（avian tembusu virus，ATMUV）感染是一种以高热、采食量骤降、产蛋率急剧下降、卵泡出血为特征的传染病。该病于2010年4月最初出现在我国东部地区（浙江、福建、山东等）种（蛋）鸭群，引起患病种（蛋）鸭群从高产蛋率（80%
‑
95%）下降至20%
‑
30%，甚至有的停产，剖检可见病鸭卵泡充血、出血。随后，蛋鸡群也出现坦布苏病毒感染，引起蛋鸡发热、采食减少或食欲废绝、产蛋急降或停止，剖检可见卵泡出血，部分卵黄破裂；鹅感染坦布苏病毒后表现产蛋急剧下降、神经症状（如摇头），剖检主要见卵巢出血或卵黄液化。此外，肉鸭、肉鸡、鸽、麻雀感染该病的报道。目前，鸭坦布苏病毒感染波及我国大部分家禽养殖区，给我国养禽业造成了巨大的经济损失。。
[0004]本专利技术建立的禽坦布苏病毒MGB TaqMan 探针实时荧光定量PCR方法不仅可用于流行病学检测且可对禽坦布苏病毒感染程度进行精确定量（比SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法敏感性更高），可有效用于禽坦布苏病毒致病机制差异研究，本专利技术可填补国内外相关研究领域空白。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的在于，针对现有技术的不足，提供一种特异性更强的禽坦布苏病毒检测试剂盒。本专利技术的检测试剂盒特异性强，灵敏度高，重复性好，能用于快速、准确的检测
禽坦布苏病。
[0006]为实现上述目的，本专利技术采用以下技术方案：一种检测禽坦布苏病毒的引物和探针，所述引物和探针的核苷酸序列如下：引物ATMUV
‑
F：5
’‑ꢀ
GGTCCTCCCCATGATTCTGA
ꢀ‑3’
；引物ATMUV
‑
R：5
’‑
AGATACCGTATTGGAAGTCCTTTCA
ꢀ‑3’
；探针ATMUV
‑
probe：5
’‑ꢀ
FAM
‑
CTCCGACTCGGGTGGT
‑
MGB
‑3’
。
[0007]上述一种检测禽坦布苏病毒的引物和探针在检测禽坦布苏病毒中的应用。
[0008]一种特异性更强的禽坦布苏病毒检测试剂盒，所述所述试剂盒包括以下组分：引物ATMUV
‑
F、引物ATMUV
‑
R、探针ATMUV
‑
probe和Probe qPCR Mix（2
×
）。
[0009]上述一种特异性更强的禽坦布苏病毒检测试剂盒，其最佳反应体系为：Probe qPCR Mix（2
×
）混合液10μL、上/下游引物（ATMUV
‑
F和ATMUV
‑
R）（20 μmol/L） 各 0.2 μL、探针（ATMUV
‑
probe）（20 μmol/L）0.4 μL、cDNA模板 1 μL、水（Nuclease
‑
free Water）补足至20 μL。
[0010]上述一种特异性更强的禽坦布苏病毒检测试剂盒，其反应条件为：95℃ 120s 预变性；95℃ 10s、60℃30s，共45个循环。
[0011]上述一种特异性更强的禽坦布苏病毒检测试剂盒在禽坦布苏病毒检测中的应用。
[0012]有益效果1、检测快速、高效：该检测方法无需进行常规琼脂糖凝胶电泳检测，反应结束后即可通过实时荧光定量PCR机器自带的程序进行结果判定。
[0013]2、定量准确：通过制备标准品、绘制标准曲线，根据检测待检样品中的Ct值，直接对禽坦布苏病毒感染给出判定，并可对其感染程度进行准确定量。
[0014]3、灵敏度高：最低可检测25.52拷贝/μL。
[0015]4、特异性强：和鸭中的常见传染病[如鸭肝炎病毒（DHV）、禽呼肠孤病毒（ReoV）、鹅细小病毒（GPV）、番鸭细小病毒（MDPV）、鸭圆环病毒（DuCV）、鸭腺病毒A型（DAdV
‑
A）、鸭瘟病毒(DEV)、鸭大肠杆菌（E. coli）、鸭疫里氏杆菌(R.A.)、鸭源禽多杀性巴氏杆菌(P.M.)]均均无反应信号，仅对禽坦布苏病毒感染检测出现荧光信号。
[0016]5、重复性好：建立的实时荧光定量PCR检测方法进行ATMUV检测的组内变异系数为0.35%
‑
2.19%，组间变异系数0.64%
‑
2.51%。
[0017]附图说明：图1 实时荧光定量PCR检测ATMUV扩增曲线。1： ATMUV扩增曲线，N：阴性对照。
[0018]图2 实时荧光定量PCR检测ATMUV标准曲线。
[0019]图3实时荧光定量PCR检测ATMUV敏感性试验。1
‑
5为模板浓度2.32
×
104拷贝/μL至2.32
×
100拷贝/μL的扩增曲线。
[0020]图4 实时荧光定量PCR检测ATMUV特异性试验。1为ATMUV；Controls为 DHV、ReoV、GPV、MDPV、DuCV、DAdV
‑
A、DEV、E. co本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种检测禽坦布苏病毒的引物和探针，其特征在于：所述引物和探针的核苷酸序列如下：引物ATMUV
‑
F：5
’‑ꢀ
GGTCCTCCCCATGATTCTGA
ꢀ‑3’
；引物ATMUV
‑
R：5
’‑
AGATACCGTATTGGAAGTCCTTTCA
ꢀ‑3’
；探针ATMUV
‑
probe：5
’‑ꢀ
FAM
‑
CTCCGACTCGGGTGGT
‑
MGB3
’
。2.如权利要求1所述的一种检测禽坦布苏病毒的引物和探针在检测禽坦布苏病毒中的应用。3.一种特异性更强的禽坦布苏病毒检测试剂盒，其特征在于：所述检测试剂盒包含权利要求1所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈珍，陈翠腾，朱春华，施少华，傅光华，黄瑜，万春和，程龙飞，陈红梅，傅秋玲，刘荣昌，
申请(专利权)人：福建省农业科学院畜牧兽医研究所，
类型：发明
国别省市：