一种HIV全基因组拼接和原发感染者中劣势耐药株的检测方法、试剂盒及其应用技术

本发明专利技术公开了一种HIV全基因组拼接和原发感染者中劣势耐药株的检测方法、试剂盒及其应用，本发明专利技术首次建立一种针对我国常用抗病毒药物相关的主要耐药位点、敏感的HIV原发感染者中劣势耐药株的检测方法以及试剂盒，所述检测方法以及试剂盒具有快速高效、敏感特异、造价低、利于推广使用等优点，不仅能够应用于临床上HIV原发感染者中劣势耐药株的检测，而且能够在我国HIV/AIDS的防控工作中发挥重要的作用，具有很好的应用价值。具有很好的应用价值。具有很好的应用价值。

【技术实现步骤摘要】
一种HIV全基因组拼接和原发感染者中劣势耐药株的检测方法、试剂盒及其应用


[0001]本专利技术属于生物医学
，具体而言，涉及一种HIV全基因组拼接和原发感染者中劣势耐药株的检测方法、试剂盒及其应用。

技术介绍

[0002]艾滋病，即获得性免疫缺陷综合征(Acquired immune deficiency syndrome，AIDS)，是由人类免疫缺陷病毒(Human immunodeficiency virus，HIV)引起的慢性致死性的传染病，由于艾滋病具有传染性和高致死性，因此已经成为世界范围内重点防控的主要疾病之一。HIV是一种带有包膜的反转录病毒，与其他反转录病毒一样，被包裹在和两个基因编码的蛋白外壳中，而其复制由基因编码的反转录酶、蛋白酶等指导完成，HIV进入人体后，选择性地入侵人体免疫系统的CD4+T淋巴细胞和巨噬细胞，在细胞内经逆转录机制合成cDNA，形成整合前复合体并整合进入宿主细胞的基因组DNA中。HIV主要传播方式包括母婴传播、性接触传播、血液传播等，可导致人体免疫功能受损，目前尚无可治愈AIDS的药物与可预防的疫苗。
[0003]自1995年Ho D.D.和George M.Shaw关于HIV病毒动力学的研究成果给抗病毒治疗带来了突破，高效抗逆转录病毒疗法(Highly active antiretroviral therapy，HAART)被认为是有效的艾滋病治疗方式。然而，抗逆转录病毒治疗(Antiretroviral treatment，ART)存在一定的缺陷：由于易整合入患者遗传物质内进入潜伏状态，病毒药物不能完全清除患者体内的病毒，因此需要长期服药，在此过程中，由于依从性、遗传特性、药物相互作用等原因，复制过程产生的耐药突变位点，发生基因突变，即发生所谓的“继发性耐药”，形成耐药毒株，在人群中传播，从而降低治疗的有效率。耐药问题是目前阻碍HIV感染者ART成功的主要障碍。此外，HIV的耐药相关突变也可以由耐药毒株携带者直接传播给从未接受过抗病毒治疗的新感染者，使这些患者从一开始就获得“原发性耐药”，被称为传播耐药(Transmitted Drug Resistance，TDR)，TDR可以显著增加患者初始抗病毒治疗失败的风险。
[0004]为了取得理想的抗病毒治疗效果，美国健康和人类服务部(Department of Health and Human Service，DHHS)抗病毒治疗指南建议：所有新发感染者在抗病毒治疗前都应进行TDR检测。但是，临床上常有未发现带有TDR的患者同样发生了不能用其他原因解释的初始抗病毒治疗失败，给临床医生造成困扰。既往研究发现，发生继发耐药的患者在停药后，由于失去了药物的选择性压力，野毒株会快速增长而适应性较差的耐药病毒株则逐渐转变成低水平复制的劣势耐药株(Minority Variants)持续存在，由于这些劣势耐药株的频次较低，常规耐药检测方法往往漏检。当再次暴露到相关药物后，这种劣势耐药株会快速复制，导致临床上的治疗失败，近年来，越来越多的证据表明，原发耐药患者中TDR同样会逐渐衰减为频次较低的劣势病毒株。
[0005]近年来，原发耐药已成为备受关注的全球性的公共卫生问题。在我国抗病毒治疗
药物相对短缺的情况下，了解我国HIV原发感染者中常用抗病毒药物相关的劣势耐药株流行状况及其对抗病毒治疗的临床影响意义重大，不仅为临床医生正确判读原发耐药检测结果，合理选择抗病毒治疗方案，减少初始抗病毒治疗失败风险提供保障，所得数据也将为我国原发耐药检测策略的制定提供重要依据。目前，我国关于艾滋病耐药检测技术市场相对空白，在技术层面上，艾滋病耐药检测主要有基因型和表型两种方法，我国常用的HIV基因型耐药检测的方法主要有ViroSeq和In
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house，两种方法均具有明显的局限性，首先，二者均采用属于第一代测序技术的Sanger测序法，这种检测技术不仅价格昂贵、低通量，且需要4
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8周才能够出结果，Sanger测序法检测HIV药物耐受性突变的敏感性低，仅为20％，因此面对HIV这种高突变率病毒存在检出率不足等问题。

技术实现思路

[0006]鉴于此，为了解决现有技术存在的上述问题，本专利技术建立了一种针对我国常用抗病毒药物相关的主要耐药位点、敏感的HIV原发感染者中劣势耐药株的检测方法以及试剂盒，所述检测方法利用新一代的高通量测序技术(NGS)建立。本专利技术提供的检测方法以及试剂盒，具有快速高效、敏感特异、造价低、利于推广使用等优点，不仅能够应用于临床上HIV原发感染者中劣势耐药株的检测，而且能够在我国HIV/AIDS的防控工作中发挥重要的作用。
[0007]为了实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：
[0008]本专利技术的第一方面提供了一种用于检测HIV全基因组和/或HIV劣势耐药株和/或HIV基因组的基因型和/或HIV全基因组的耐药突变位点的序列组。
[0009]进一步，所述序列组包括RT
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PCR的引物序列、测序的接头序列；
[0010]优选地，所述RT
‑
PCR的引物序列如SEQ ID NO:1
‑
SEQ ID NO:2所示；
[0011]优选地，所述测序的接头序列如SEQ ID NO:3
‑
SEQ ID NO:194所示；
[0012]优选地，所述耐药基因的耐药突变位点位于HIV基因组的Pol基因上；
[0013]更优选地，所述Pol基因包含逆转录酶基因和蛋白酶基因；
[0014]优选地，所述耐药突变位点为抗病毒药物相关的耐药突变位点；
[0015]更优选地，所述抗病毒药物包括拉米夫定、阿巴卡韦、齐多夫定、恩曲他滨、替诺福韦、依非韦伦、依曲韦林；
[0016]更优选地，所述耐药突变位点包括I54、M184、K65、K103、Y181。
[0017]HIV属于病毒科慢病毒属中的人类慢病毒组，为直径100
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120nm的球形颗粒，由核心和包膜两部分组成；核心由衣壳蛋白(CA，p24)所组成，衣壳内包括两条完全一样的病毒单股正链RNA、核壳蛋白(NC)和病毒复制所必需的酶类，含有逆转录酶(RT，p51/p66)、整合酶(IN，p32)和蛋白酶(PR，p10)；HIV最外层为包膜，来源于宿主细胞膜的膜质结构，其中嵌有外膜糖蛋白gp120和跨膜糖蛋白gp41；包膜结构之下的是基质蛋白(MA，p17)，形成一个病毒内壳；HIV基因组全长约9.7
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103bp，含有3个结构基因(gag、pol和env)、2个调节基因(tat反式激活因子和rev毒粒蛋白表达调节因子)和4个辅助基因(nef负调控因子、vpr病毒蛋白r、vpu病毒蛋白u和vif病毒感染因子)；HIV是一种变异性很强的病毒，各基因的变异程度不同，env基因变异率最高；我国以HIV
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1为主要流行株，已发现的有A、B(欧美B)、B
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于检测HIV全基因组和/或HIV劣势耐药株和/或HIV基因组的基因型和/或HIV全基因组的耐药突变位点的序列组，其特征在于，所述序列组包括RT
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PCR的引物序列、测序的接头序列；优选地，所述RT
‑
PCR的引物序列如SEQ ID NO:1
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SEQ ID NO:2所示；优选地，所述测序的接头序列如SEQ ID NO:3
‑
SEQ ID NO:194所示；优选地，所述耐药基因的耐药突变位点位于HIV基因组的Pol基因上；更优选地，所述Pol基因包含逆转录酶基因和蛋白酶基因；优选地，所述耐药突变位点为抗病毒药物相关的耐药突变位点；更优选地，所述抗病毒药物包括拉米夫定、阿巴卡韦、齐多夫定、恩曲他滨、替诺福韦、依非韦伦、依曲韦林；更优选地，所述耐药突变位点包括I54、M184、K65、K103、Y181。2.一种用于检测HIV全基因组和/或HIV劣势耐药株和/或HIV基因组的基因型和/或HIV全基因组的耐药突变位点的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含如下试剂：RT
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PCR扩增试剂：如SEQ ID NO:1
‑
SEQ ID NO:2所示的扩增引物；文库制备试剂：如SEQ ID NO:3
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SEQ ID NO:194所示的接头序列；优选地，所述耐药突变位点为抗病毒药物相关的耐药突变位点；更优选地，所述抗病毒药物包括拉米夫定、阿巴卡韦、齐多夫定、恩曲他滨、替诺福韦、依非韦伦、依曲韦林；更优选地，所述耐药突变位点包括I54、M184、K65、K103、Y181。3.一种HIV的检测方法，其特征在于，所述方法包括方法A1和/或方法A2：方法A1：一种敏感的HIV全基因组和/或HIV劣势耐药株的检测方法；方法A2：一种敏感的HIV基因组的基因型和/或HIV全基因组的耐药突变位点的检测方法；所述方法A1和A2均包括如下步骤：(1)病毒核酸提取：提取待测样本中的HIV病毒RNA；(2)引物设计和PCR扩增：采用权利要求1中所述的RT
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PCR的引物序列进行HIV基因组的...

【专利技术属性】
技术研发人员：张滋婷，陈文兵，蔡昆，
申请(专利权)人：北京微未来科技有限公司，
类型：发明
国别省市：