一种新型冠状病毒全基因组捕获方法、引物组以及试剂盒技术

本发明专利技术涉及一种超灵敏度新型冠状病毒全基因组捕获方法、引物组以及试剂盒，本发明专利技术需少量RNA便可方便快速的扩增出新型冠状病毒全基因组，可直接对接二代测序建库试剂和三代测序平台，获得新型冠状病毒全基因组序列。

A novel coronavirus whole genome capture method, primer set and kit

【技术实现步骤摘要】
一种新型冠状病毒全基因组捕获方法、引物组以及试剂盒
本专利技术属于病毒检测领域，具体涉及到一种新型冠状病毒全基因组捕获方法、引物组以及试剂盒。
技术介绍
2019年12月下旬，中国武汉报道了因不明微生物病原体导致的病毒性肺炎患者,一种新型冠状病毒随后被确定为致病病原体。研究表明，最初从9例患者中获得该新型冠状病毒的10个基因组序列极为相似，序列一致性超过99.98%。值得注意的是，此新型冠状病毒与2018年在中国东部舟山采集的两种类似于SARS的冠状病毒bat-SL-CoVZC45和bat-SL-CoVZXC21密切相关(88%的一致性)，但与SARS-CoV(约79%)和MERS-CoV(约50%)的距离较远。此新型冠状病毒与SARS-CoV有足够的差别，被认为是一种新型的人感染口鼻病毒。国际病毒分类委员会的冠状病毒研究小组将其正式命名为：严重急性呼吸综合征冠状病毒2（severeacuterespiratorysyndromecoronavirus2,SARS-CoV-2)，尤其所致的疾病由世界卫生组织（WHO）命名为COVID-19，其中“Co”代表冠状，“Vi”为病毒，“D”为疾病。该疾病造成中国境内上万人感染，并引起全球大流行，日本、新加坡等几十国家都有病例出现，并报告有医务工作者和家庭群集感染，确认了人际传播。大多数受感染的病人有高热，有些有呼吸困难，胸片显示双肺有侵袭性病变。因此，SARS-CoV-2的病原学诊断对我国传染病防控至关重要，开发相应的快速鉴定试剂具有重大的社会和经济意义。冠状病毒为不分节段的单股正链RNA病毒，长度从2.6万到3.2万个碱基不等，根据血清型和基因组特点冠状病毒亚科被分为α、β、γ、δ四个属。SARS-CoV-2属于β属，全长29847bp。自2020年1月26日以来，已有7个新型冠状病毒核酸检测试剂盒产品陆续通过国家药品监督管理局应急审批，获得上市批件。SARS-CoV-2鉴定试剂盒以荧光定量PCR方法为主，实践显示其检测特异性高，成本低，操作方便。但是，该类试剂盒是根据已知病毒序列设计特异性引物和探针，因此只能鉴别已知病毒类型，不能鉴定未知新型病毒；此外，由于病毒基因序列变异，会导致引物和探针扩增失败，检测敏感性降低，因此需要定期更换引物和探针，并重新进行实际评估，而且应用荧光定量PCR方法鉴定SARS-CoV-2假阴性情况经常发生，甚至出现过6次检测才有1次阳性的情况。此外，基于宏基因组测序（metagenomicsNextGenerationSequencing，简称“mNGS”，又称“宏基因组学”）的检测试剂盒也已获批，能够鉴别诊断包括新型冠状病毒在内的其他冠状病毒和呼吸道病原的感染，实现病毒序列的快速检测。基于宏基因组新一代测序技术(mNGS)不依赖于传统的微生物培养，直接对临床样本中的核酸进行高通量测序，能够快速、客观的检测临床样本中的多种病原微生物（包括病毒、细菌、真菌、寄生虫），尤其适用于急危重症和疑难感染的诊断。随着mNGS技术平台的完善和临床研究的增多，mNGS在临床上的运用将越来越广泛。2016年美国FDA认可用二代测序技术进行微生物鉴定及耐药毒力分析；2019年病原宏基因组学被写入成人医院获得性肺炎与呼吸机相关性肺炎诊断和治疗指南。测序指的是对基因的序列进行判断的一种方法。每个物种的基因控制生物性状的表达，而测序是指对基因的序列进行判断。第二代测序（NGS）又称为高通量测序（High-throughputsequencing），是基于PCR和基因芯片发展而来的DNA测序技术。目前测序技术已发展到第三代，第三代测序技术是指单分子测序技术。DNA测序时，不需要经过PCR扩增，实现了对每一条DNA分子的单独测序。第三代测序技术也叫从头测序技术，即单分子实时DNA测序。近年，新一代测序技术（NGS）（也称之为二代测序）和纳米孔测序技术（Nanopore)(也称之为三代测序）越来越多的应用于未知病原体的诊断。中国的科学家能够在SARS-CoV-2爆发后的较短时间内，获得病毒基因组全序列，也都是得益于测序技术。通常，测序技术在疫情爆发中有三个作用：1、鉴定未知病原体，只有获得病原全基因组才能确定新病原的身份；2、疫情发展阶段可用于直接对临床样品开展检测，实时动态监测病毒基因组的突变情况以及辅助假阴性样本确诊；3、疫情常规检测阶段，可以用于耐药位点筛选，也可以用于日常的呼吸道感染鉴别，提升呼吸道疾病的检测准确度。目前测序技术鉴定SARS-CoV-2方法有：病原宏基因组测序以及探针捕获测序病原宏基因组测序（mNGS）是目前临床上针对病原最常用的基因测序方法，是一种基于二代测序技术的无需培养、无偏好性的病原检测技术，可一次性完成细菌、真菌、病毒和寄生虫等多种病原体检测。探针捕获的原理是人为设计探针（DNA或者RNA形式），探针可以和目标区段部分或者全部互补。将样本和探针混合，探针会将目标区段捕获，未设计探针的区段会被洗脱丢弃，之后通过变性（一般是调节PH值到碱性）将探针和捕获区段分开，被捕获的片段即可进行二代测序文库构建。然而，应用情景的差异诸多复杂因素共同影响了病原全基因组获得的成功率，同时还面临在检测一线人员在任务重压下的时间、人力、高企的测序成本等问题。因此，病原宏基因组测序（mNGS）可用于阴性样本确诊，但是不容易拿到全基因组信息，并且存在操作复杂、检测时间相对较长（需要24-72小时）等原因，在新型冠状病毒的检测上无法实现大范围推广、快速诊断的目的。作为一种技术性补充，基于扩增的基因组捕获方法，是一种“Culture-free”的病毒基因组特异富集测序方案，操作简便、成本较低，适于疫情防控的当前需求，然而现有的探针捕获测序方法操作步骤复杂，主要有7大部分不同的技术操作，每一部分的操作都需要5个步骤以上，多的甚至能达到33步，并且一旦进行操作，为满足检测的要求，每一部分内的操作不能暂停，必须持续完成。这样就给实际操作带来了很多不可控性和操作复杂性。
技术实现思路
本专利技术的目的在于给疾控及科研人员提供一种快速、方便、经济的获取SARS-CoV-2全基因组的方法，该方法通过SARS-CoV-2分离毒株基因组全序列设计多对叠瓦式PCR扩增引物，加上高效逆转录体系和高保真Tag酶扩增体系，仅需少量RNA便可方便快速的扩增出新型冠状病毒全基因组，可完美对接二代测序建库试剂和三代测序平台，可快速方便地获得新型冠状病毒全基因组序列，实现新冠病毒的检测。具体的，本专利技术涉及一种新型冠状病毒检测的序列组合，所述序列组合包括针对SARS-CoV-2分离毒株基因组全序列设计的98对叠瓦式PCR扩增引物，所述98对扩增引物序列依次为SEQIDNo.1-196。本专利技术还涉及一种试剂盒，其包含新型冠状病毒检测的序列组合，所述序列组合包括针对SARS-CoV-2分离毒株基因组全序列设计的98对叠瓦式PCR扩增引物，所述98对扩增引物序列依次为SEQIDNo.1-196。另一方面，本专利技术涉及一种新型冠状病毒检测的测序片段捕获方法，本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种新型冠状病毒检测的序列组合，其特征在于，所述序列组合包括针对SARS-CoV-2分离毒株基因组全序列设计的98对叠瓦式PCR扩增引物，所述98对扩增引物序列依次为SEQ ID No.1-196。/n

【技术特征摘要】
1.一种新型冠状病毒检测的序列组合，其特征在于，所述序列组合包括针对SARS-CoV-2分离毒株基因组全序列设计的98对叠瓦式PCR扩增引物，所述98对扩增引物序列依次为SEQIDNo.1-196。


2.一种试剂盒，其包含新型冠状病毒检测的序列组合，其特征在于，所述序列组合包括针对SARS-CoV-2分离毒株基因组全序列设计的98对叠瓦式PCR扩增引物，所述98对扩增引物序列依次为SEQIDNo.1-196。


3.一种超灵敏新型冠状病毒检测的测序片段捕获方法，其特征在于，具体步骤包括：
（1）RNA提取：将标本中的冠状病毒进行病毒RNA提取；
（2）引物设计与PCR扩增：使用针对SARS-CoV-2保守区域设计的98对扩增引物，所述引物序列依次...

【专利技术属性】
技术研发人员：张滋婷，韩月婷，陈文兵，
申请(专利权)人：北京微未来科技有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11