【技术实现步骤摘要】
一种生物标记组合应用的评价方法
本专利技术涉及细菌检测研究领域，特别涉及一种生物标记组合应用的评价方法。
技术介绍
动物粪便中含有大量从体内排出的病原微生物和肠道病毒，未经处理排放至环境水体中会导致介水性疾病的爆发，给人类健康带来极大风险。例如，2003年发生的SARs病毒传染和2020年爆发的新型冠状病毒疫情均有可能通过“粪-口”传播的方式感染人类，引起呼吸道方面的疾病。此外，粪便在环境中自身分解所产生的醇类、酚类、氨、苯和硫化氢等也会造成水环境的污染。因此，如何准确识别水环境中存在的粪便污染并制定有效的污染防治措施，是改善水质质量、保护人民用水健康的关键问题。粪大肠菌群和大肠埃希氏菌等传统指示菌作为最早开发出的反应水体粪便污染状况的微生物指标，已被世界各国沿用多年。中国的地表水环境质量标准（GB3838-2002）中也包含了与粪大肠菌群检出浓度相对应的水质评价标准。然而，此类传统指示菌广泛存在于各类动物粪便中，仅能用于评价水体中的粪便污染程度，无法识别污染来源，也不能对各污染源进行定量化解析，从而导致水体微生物污...
【技术保护点】
1.一种生物标记组合应用的评价方法，其特征在于，包括步骤：/nS1：采集样品，并提取DNA；/nS2：选取特异性引物；/nS3：制作qPCR反应和标准曲线；/nS4：为识别引物在不同动物粪便中的浓度分布特征，选取目标源强特征和非目标物种干扰强度作为参数评价引物特性；/nS5：计算特异性标记物在目标样本库中检出浓度的上四分位点与各非目标物种中假阳性信号的下四分位点的差值，根据所述差值实现非目标物种干扰强度的分类；/nS6：建立标记物组合方法，步骤是以数字代表非目标物种对标记物的干扰强度，标记物组合是指从n个不同的标记物中任取m个引物并组成一组，来模拟能检测到n种标记物的实验室...
【技术特征摘要】
1.一种生物标记组合应用的评价方法，其特征在于，包括步骤：
S1：采集样品，并提取DNA；
S2：选取特异性引物；
S3：制作qPCR反应和标准曲线；
S4：为识别引物在不同动物粪便中的浓度分布特征，选取目标源强特征和非目标物种干扰强度作为参数评价引物特性；
S5：计算特异性标记物在目标样本库中检出浓度的上四分位点与各非目标物种中假阳性信号的下四分位点的差值，根据所述差值实现非目标物种干扰强度的分类；
S6：建立标记物组合方法，步骤是以数字代表非目标物种对标记物的干扰强度，标记物组合是指从n个不同的标记物中任取m个引物并组成一组，来模拟能检测到n种标记物的实验室条件，计算不同组合相应的评分，根据该评分得到该组合的评价结果。
2.根据权利要求1所述的生物标记组合应用的评价方法，其特征在于，步骤S1中，DNA提取的方法是：采用粪便基因组提取试剂盒，每份粪便混匀后称取一定量放入灭菌离心管中，进而按照试剂盒说明书进行DNA提取。
3.根据权利要求1所述的生物标记组合应用的评价方法，其特征在于，步骤S3中，在选取特异性引物后，以不同人和动物的粪便样本DNA为模板，对选取的各类宿主特异性引物进行扩增；为构建标准品，对各特异性引物采用对应的样本DNA进行PCR扩增，扩增后的目标产物通过DNA纯化试剂盒进行纯化回收；
回收后的噬菌体引物扩增产物连接到pGEM®-T载体上，其它回收产物连接到pMD19-TVector载体上，连接完成后，均转化至DH5α感受态细胞，采用氨苄抗生素含量为1:1000的平板培养基筛取阳性克隆，并提取质粒DNA，同时测定相应的DNA浓度，计算目的片段拷贝数；制备的质粒均进行10倍梯度稀释，稀释为10-0,10-1，10-2，10-3，10-4，10-5，10-67个梯度；以各梯度质粒为模板，每个梯度设置3个重复，进行qPCR扩增，通过反应获得的Cq值构建相应的标准曲线，各标准曲线的相关系数均大于0.97，且扩增效率在90-110%之间，表明各标准曲线合格。
4.根据权利要求3所述的生物标记组合应用的评价方法，其特征在于，qPCR扩增包括...
【专利技术属性】
技术研发人员：吴仁人，张杨，陆俊卿，陈均权，
申请(专利权)人：生态环境部华南环境科学研究所，
类型：发明
国别省市：广东;44
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