一种腺病毒全基因组捕获方法、引物组以及试剂盒技术

本发明专利技术涉及一种腺病毒全基因组捕获方法、引物组以及试剂盒，本发明专利技术需少量RNA便可方便快速的扩增出腺病毒全基因组，可直接对接二代测序建库试剂和三代测序平台，获得腺病毒全基因组序列。

【技术实现步骤摘要】
一种腺病毒全基因组捕获方法、引物组以及试剂盒
本专利技术属于病毒检测领域，具体涉及到一种腺病毒全基因组捕获方法、引物组以及试剂盒。
技术介绍
人腺病毒（Humanadenovirus，HAdV）肺炎是儿童社区获得性肺炎中较为严重的类型之一，多发生于6个月至5岁儿童，部分患儿临床表现重，肺炎并发症多，重症病例易遗留慢行气道和肺疾病，是目前造成婴幼儿肺炎死亡和致残的重要原因之一。HAdV属于哺乳动物腺病毒属，为无包膜的双链DNA病毒，目前已发现至少90个基因型，分为A-G共7个亚属，不同型别HAdV的组织侵染性，致病力，流行地区等特征不同。与呼吸道感染相关的HAdV主要有B亚属（HAdV-3、7、11、14、16、21、50、55型），C亚属（HAdV-1、2、5、6、57型）和E亚属（HAdV-4型），腺病毒肺炎约占社区获得性肺炎的4%-10%，重症肺炎以3型及7型多见。在中国主要流行的是腺病毒3型，7型，11型，14型，55型。腺病毒核酸检测的方法灵敏度和特异度较高，目前以荧光定量PCR方法为主，实践显示其检测特异性高，成本低，操作方便。但是，该类试剂盒是根据已知病毒序列设计特异性引物和探针，因此只能鉴别已知病毒类型，不能鉴定未知新型病毒；此外，由于病毒基因序列变异，会导致引物和探针扩增失败，检测敏感性降低，因此需要定期更换引物和探针，并重新进行实际评估，而且应用荧光定量PCR方法鉴定腺病毒假阴性情况经常发生。此外，基于宏基因组测序（metagenomicsNextGenerationSequencing，简称“mNGS”，又称“宏基因组学”）的检测方法，能够鉴别诊断包括腺病毒在内的其他呼吸道病原的感染，实现病毒序列的快速检测。基于宏基因组新一代测序技术(mNGS)不依赖于传统的微生物培养，直接对临床样本中的核酸进行高通量测序，能够快速、客观的检测临床样本中的多种病原微生物（包括病毒、细菌、真菌、寄生虫），尤其适用于急危重症和疑难感染的诊断。随着mNGS技术平台的完善和临床研究的增多，mNGS在临床上的运用将越来越广泛。2016年美国FDA认可用二代测序技术进行微生物鉴定及耐药毒力分析；2019年病原宏基因组学被写入成人医院获得性肺炎与呼吸机相关性肺炎诊断和治疗指南。测序指的是对基因的序列进行判断的一种方法。每个物种的基因控制生物性状的表达，而测序是指对基因的序列进行判断。第二代测序（NGS）又称为高通量测序（High-throughputsequencing），是基于PCR和基因芯片发展而来的DNA测序技术。目前测序技术已发展到第三代，第三代测序技术是指单分子测序技术。DNA测序时，不需要经过PCR扩增，实现了对每一条DNA分子的单独测序。第三代测序技术也叫从头测序技术，即单分子实时DNA测序。近年，新一代测序技术（NGS）（也称之为二代测序）和纳米孔测序技术（Nanopore)(也称之为三代测序）越来越多的应用于未知病原体的诊断。目前全球爆发的SARS-CoV-2病毒能在较短时间内，获得病毒基因组全序列，也都是得益于测序技术。通常，测序技术在疾病流行和爆发中有三个作用：1、鉴定未知病原体，只有获得病原全基因组才能确定新病原的身份；2、流行病发展阶段可用于直接对临床样品开展检测，实时动态监测病毒基因组的突变情况以及辅助假阴性样本确诊；3、常规检测阶段，可以用于耐药位点筛选，也可以用于日常的呼吸道感染鉴别，提升呼吸道疾病的检测准确度。目前测序技术鉴定腺病毒的方法有：病原宏基因组测序以及探针捕获测序病原宏基因组测序（mNGS）是目前临床上针对病原最常用的基因测序方法，是一种基于二代测序技术的无需培养、无偏好性的病原检测技术，可一次性完成细菌、真菌、病毒和寄生虫等多种病原体检测。探针捕获的原理是人为设计探针（DNA或者RNA形式），探针可以和目标区段部分或者全部互补。将样本和探针混合，探针会将目标区段捕获，未设计探针的区段会被洗脱丢弃，之后通过变性（一般是调节PH值到碱性）将探针和捕获区段分开，被捕获的片段即可进行二代测序文库构建。然而，应用情景的差异诸多复杂因素共同影响了病原全基因组获得的成功率，同时还面临在检测一线人员在任务重压下的时间、人力、高企的测序成本等问题。因此，病原宏基因组测序（mNGS）可用于阴性样本确诊，但是不容易拿到全基因组信息，并且存在操作复杂、检测时间相对较长（需要24-72小时）等原因，在腺病毒的检测上无法实现大范围推广、快速诊断的目的。作为一种技术性补充，基于扩增的基因组捕获方法，是一种“Culture-free”的病毒基因组特异富集测序方案，操作简便、成本较低，适于流行病防控的当前需求，然而现有的探针捕获测序方法操作步骤复杂，主要有7大部分不同的技术操作，每一部分的操作都需要5个步骤以上，多的甚至能达到33步，并且一旦进行操作，为满足检测的要求，每一部分内的操作不能暂停，必须持续完成。这样就给实际操作带来了很多不可控性和操作复杂性。
技术实现思路
本专利技术的目的在于给疾控及科研人员提供一种快速、方便、经济的获取腺病毒多种亚型的全基因组的方法，该方法通过对腺病毒3型，7型，11型，14型，55型分离毒株基因组全序列设计多对叠瓦式PCR扩增引物，加上高效逆转录体系和高保真Tag酶扩增体系，仅需少量RNA便可方便快速的扩增出腺病毒多种亚型的全基因组，可完美对接二代测序建库试剂和三代测序平台，可快速方便地获得腺病毒5种亚型的全基因组序列。本专利技术第一方面，提供了一种腺病毒检测的序列组合，所述的序列组合包括针对腺病毒基因组全序列设计的16条PCR扩增引物，所述16条扩增引物序列依次包括SEQIDNo.1-16或SEQIDNo：1-16中的序列经过一个或几个核苷酸的取代、缺失和/或插入且与相应的SEQIDNo:1-16具有相同功能的DNA分子；进一步优选的，所述的扩增引物设计方式为叠瓦式PCR。优选的，所述的序列组合根据腺病毒3型，7型，11型，14型，55型设计。本专利技术第二方面，提供了一种试剂盒，其包含腺病毒检测的序列组合，所述序列组合包括针对腺病毒基因组全序列设计的16条PCR扩增引物，所述16条扩增引物序列依次包括SEQIDNo.1-16或SEQIDNo：1-16中的序列经过一个或几个核苷酸的取代、缺失和/或插入且与相应的SEQIDNo:1-16具有相同功能的DNA分子；优选的，所述的扩增引物设计方式为叠瓦式PCR。优选的，所述的序列组合根据腺病毒3型，7型，11型，14型，55型设计。优选地，所述试剂盒还包含RT-PCR扩增体系，进一步优选的，现有技术中常规的高效逆转录体系和高保真Tag酶扩增体系均可用于本专利技术，更优选的，所述RT-PCR扩增体系可用商品化的体系，例如SurSpritIIIONE-STEPRT-PCR扩增体系。本专利技术的第三方面，提供了一种腺病毒检测的测序片段捕获方法，具体步骤包括：（1）RNA提取：将标本中的腺病毒进行病毒RNA提取；（2）引物设计与PCR扩增：使用针对腺病毒保守区域设计的本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种腺病毒检测的序列组合，其特征在于，所述的序列组合包括针对腺病毒基因组全序列设计的16条叠瓦式PCR扩增引物，所述16条扩增引物序列依次包括SEQ ID No.1-16或SEQ ID No：1-16中的序列经过一个或几个核苷酸的取代、缺失和/或插入且与相应的SEQID No:1-16具有相同功能的DNA分子。/n

【技术特征摘要】
1.一种腺病毒检测的序列组合，其特征在于，所述的序列组合包括针对腺病毒基因组全序列设计的16条叠瓦式PCR扩增引物，所述16条扩增引物序列依次包括SEQIDNo.1-16或SEQIDNo：1-16中的序列经过一个或几个核苷酸的取代、缺失和/或插入且与相应的SEQIDNo:1-16具有相同功能的DNA分子。


2.根据权利要求1所述的腺病毒检测的序列组合，其特征在于，所述的序列组合根据腺病毒3型，7型，11型，14型，55型设计。


3.一种试剂盒，其包含腺病毒检测的序列组合，其特征在于，所述序列组合包括针对腺病毒基因组全序列设计的16条叠瓦式PCR扩增引物，所述16条扩增引物序列依次包括SEQIDNo.1-16或SEQIDNo：1-16中的序列经过一个或几个核苷酸的取代、缺失和/或插入且与相应的SEQIDNo:1-16具有相同功能的DNA分子。


4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述的序列组合根据腺病毒3型，7型，11型，14型，55型设计。


5.一种腺病毒检测的测序片段捕获方法，其特征在于，具体步骤包括：
（1）RNA提取：将标本中的腺病毒进行病毒RNA提取；
（2）引物设计与PCR扩增：使用针对腺病毒保守区域设计的16条扩增引物...

【专利技术属性】
技术研发人员：张滋婷，李惠芬，陈文兵，
申请(专利权)人：北京微未来科技有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11