【技术实现步骤摘要】
一种高效生产类克隆鸡的方法
[0001]本专利技术涉及一种高效生产类克隆鸡的方法，属于生物
技术介绍
[0002]体细胞克隆技术在哺乳动物上被广泛地用来研究细胞特性，在研究基因结构和功能、基因治疗、遗传病的发生和治疗、濒危动物物种复原等方面具有巨大的应用价值。然而，这一技术在鸟类和两栖类等卵生动物上无法实施，这极大的限制了禽类科研和生产研究相关的发展。而禽类PGCs移植技术提供了一种生产类克隆鸡的替代方案。2006年，Larval等进行了鸡异体间PGCs移植并产生了后代，证明了这是目前在家禽中唯一可高效实现体细胞克隆的途径。但是，原代分离的PGCs数量较少，远不能满足实际移植时的需求，这就限制了该技术的应用。通过ESCs诱导PGCs作为解决PGCs来源的技术仍然存在获取困难、数量少的问题。而体细胞重编程可将易于获得的皮肤或组织细胞诱导为iPSCs，研究亦表明全能干细胞能够在体外被诱导形成PGCs，这能够有效的解决目前鸡PGCs难以大量获取的关键问题。但是目前在家禽上尚未有明确的技术方案，这极大的限制了克隆技术在家禽...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种高效生产类克隆鸡的方法，其特征是，包括以下步骤：（1）、构建OCT4, SOX2, NANOG, LIN28四因子的慢病毒过表达载体并转染黑羽狼山鸡成纤维细胞CEF；（2）、利用第一诱导培养基将转染四因子的狼山鸡成纤维细胞CEF诱导为iPSCs，在诱导的第5天细胞形态发生显著变化，逐渐聚集变圆，贴壁能力下降，此时将细胞转移至丝裂霉素处理后的CEF饲养层上培养，整个诱导过程持续21天；对诱导形成的iPSCs进行传代并进行鉴定；第一诱导培养基配方为Knockout DMEM、10%FBS、0.1mmol/Lβ
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巯基乙醇、1%非必需氨基酸、1000IU/mLLIF、10ng/mLbFGF、5ng/mL SCF、1%的青链霉素、2%鸡血清；（3）、利用第二诱导培养基将诱导形成的iPSCs进行诱导分化为PGC
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like，并通过PAS糖原染色、间接免疫荧光进行鉴定；第二诱导培养基配方为基础因子培养基、40ng/ml BMP4、40ng/ml BMP8b 、50ng/ml ...
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