【技术实现步骤摘要】
一种永生化林麝香腺上皮细胞的构建方法
[0001]本专利技术涉及动物组织培养
，具体来说是一种永生化林麝香腺上皮细胞的构建方法。
技术介绍
[0002]麝香是传统中药的重要成分。《中国药典》2020年版记载，麝香具有开窍醒神，活血通经，消肿止痛的功效。现代药学著作均视麝香为药材之珍品。在中成药及成药的实际应用中，麝香常居牛黄、犀角、熊胆等名贵动物药材之首。《全国中成药处方集》收载的2621个处方中，含麝香的处方就有295个。由于天然麝香的产量极低，每头雄性林麝每年只能产15克左右，因此麝香就显得极其珍贵，市场价格在黄金的3倍以上，香腺上皮细胞是香腺中起分泌作用的功能细胞，每年5月下旬前后，林麝香腺开始肿大，香腺细胞分泌的初香液顺着导管流入香囊中。这些研究结果使人们对林麝香腺的宏观解剖结构与超微结构有了较为全面的了解。
[0003]为了满足市场对麝香的需求，近年来，科研人员正积极寻求通过细胞生物学体外培养的方法获取麝香。前人也为此进行了尝试，但无法克服林麝香腺组织采集困难、香腺上皮细胞培养时生长缓慢、林麝香腺上皮
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种永生化林麝香腺上皮细胞的构建方法，其特征在于：包括下述步骤：(1)采集在泌香期患病死亡的雄性成年林麝香腺组织；(2)将步骤(1)采集的林麝香腺组织的林麝香腺上皮细胞与成纤维细胞进行分离纯化，得到纯化后的林麝香腺上皮细胞；(3)将步骤(2)得到的纯化后的林麝香腺上皮细胞慢病毒转染，获得转染的林麝香腺上皮细胞；(4)将步骤(3)中得到的转染的林麝香腺上皮细胞通过嘌呤霉素筛选出转染成功的林麝香腺上皮细胞；(5)对筛选出的转染成功的林麝香腺上皮细胞进行扩增培养，即可获得永生化林麝香腺上皮细胞。2.根据权利要求1所述的永生化林麝香腺上皮细胞的构建方法，其特征在于：所述步骤(1)中，所述林麝香腺组织采集后立即转移至含有青链霉素的PBS中。3.根据权利要求2所述的永生化林麝香腺上皮细胞的构建方法，其特征在于：所述青链霉素为100U/ml。4.根据权利要求1所述的永生化林麝香腺上皮细胞的构建方法，其特征在于：所述步骤(2)中，林麝香腺上皮细胞与成纤维细胞进行分离纯化的方法包括下述步骤：
①
将步骤(1)采集的林麝香腺组织剪碎至1
‑
2mm3；然后在0.05
‑
0.3％的IV型胶原酶36
‑
38℃消化3
‑
5小时；然后用完全培养基重悬浮洗涤2
‑
4次；1300
‑
2000r/m离心2
‑
3min，收集上清液；
②
将步骤
①
收集的上清液接种于完全培养基中，所述完全培养基中血清的含量为10％；在37℃、5％二氧化碳、饱和湿度下进行培养，每24h
‑
36h换液1次；
③
培养3
‑
5天后，待成纤维细胞贴壁，而上皮细胞未贴壁时，吸取上清液，接种于另一个细胞瓶中；
④
继续培养2
‑
3天后，上皮细胞开始贴壁生长，更换完全培养基，更换的完全培养基中血清含量为2
‑
5％；如还有成纤维细胞贴壁，则采用无菌接种环刮除成纤维细胞团块；
⑤
继续培养7
‑
10天后，单层上皮细胞加速生长时，更换完全培养基，更换的完全培养基中血清含量为8
‑
10％，继续进行培养；培养后得到纯化后的林麝香腺上皮细胞。5.根据权利要求4所述的永生化林麝香腺上皮细胞的构建方法，其特征在于：所述步骤
①
和步骤
②
中所使用的完全培养基是以DMEM为基础培养基，并添加有双抗、血清和EPC因子，所述双抗的含量为1％，所述血清的含量为10％，所述EPC因子的含量为10
‑
15ng/ml；所述步骤
③
中所使用的完全培养基是以DMEM为基础培养基，并添加有双抗、血清和EPC因子，所述双抗的含量为1％，所述血清的含量为2
‑
5％，所述EPC因子的含量为10
‑
15ng/ml；所述步骤
⑤
中所使用的完全培养基是以DMEM为基础培养基，并添加有双抗、血清和EPC因子，所述双抗的含量为1％，所述血清...
【专利技术属性】
技术研发人员：竭航，郑程莉，赵春容，张明，任妍，
申请(专利权)人：四川养麝研究所，
类型：发明
国别省市：
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