GCGR报告基因稳转细胞株及其构建方法和应用技术

本发明专利技术公开了GCGR报告基因稳转细胞株及其构建方法和应用，该细胞株细胞膜表达GCGR受体，该细胞株包含多聚核苷酸，该多聚核苷酸有CRE结合的结合序列，连接下游的启动子，该启动子连接一个开放阅读框，该阅读框表达一个报告基因蛋白。本申请的发明专利技术人构建了GCGR报告基因稳转细胞株，并利用该细胞株开发出不限于GCGR激动剂类和拮抗剂类药物的生物活性测定方法，生物分析定量方法和中和抗体测定方法。解决了检测步骤繁琐时间成本高，试剂耗材成本较高，实验数据解读复杂，方法不够灵敏、抗干扰能力差、不能完全表征GCGR激活/拮抗机理和效果，不具备通用性等难题。具备通用性等难题。具备通用性等难题。

【技术实现步骤摘要】
GCGR报告基因稳转细胞株及其构建方法和应用


[0001]本专利技术涉及生物医药
，具体涉及一种GCGR报告基因稳转细胞株构建方法和应用。

技术介绍

[0002]GCGR(UniProt ID：P47871)是胰高血糖素(glucagon)的受体，属于G蛋白偶联受体家族的一员，该受体在调节血糖的水平，保持血糖的稳态上发挥了关键的作用。GCGR通过胰高血糖素激活后发挥生理功能，胰高血糖素具有很强的促进糖原分解和糖异生作用，使血糖明显升高，1mol/L的激素可使3
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106mol/L的葡萄糖迅速从糖原分解出来。胰高血糖素通过cAMP
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PK系统，激活肝细胞的磷酸化酶，加速糖原分解。在GCGR的信号通路中，胰高血糖素通过和细胞膜表面的GCGR结合激活胞内的信号，导致细胞内的腺苷酸环化酶活化和胞内cAMP浓度的上升，cAMP浓度的上升激活蛋白激酶A(cyclic
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AMP dependent protein kinase A)，最终磷酸化CRE转录因子，磷酸化CRE处于活化状态，进入细胞核激活本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种GCGR报告基因稳转细胞株的构建方法，其特征在于，构建步骤如下：S1，使用CRE报告基因质粒转染293T细胞，通过加入真核抗生素筛选和单克隆挑选，经过功能学评价，挑选得到合适的CRE报告基因稳转细胞株单克隆；S2，使用GCGR慢病毒感染含CRE报告基因稳转细胞株单克隆细胞，通过加入真核抗生素筛选和单克隆挑选，经过功能学评价得到合适的GCGR报告基因稳转细胞株。2.根据权利要求1所述的一种GCGR报告基因稳转细胞株的构建方法，其中，步骤S1中，将CRE报告基因质粒和X
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tremeGENE HP DNA转染试剂使用opti
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MEM培养基混合均匀，室温静置后加入有1ml DMEM 60％汇合度的293T细胞的6孔板单孔中，第二天进行细胞换液，第三天转入T25细胞培养瓶中进行传代并且加入0.5μg/ml puromycin的DMEM培养基中进行加压培养；细胞大部分死亡，维持0.5μg/ml puromycin DMEM生长传代3次后，将细胞以1个/孔，200ul/孔进行96孔板单克隆铺板，96孔板单克隆铺板14天后，显微镜下观察每个孔的细胞状况，并挑选出单克隆进入24孔板，24孔板细胞经过1周培养后转入6孔板，然后经T25,T75,T175放大培养得到单克隆。3.根据权利要求1所述的一种GCGR报告基因稳转细胞株的构建方法，其中，步骤S2中，将GCGR基因慢病毒载体加入有1ml DMEM 45％汇合度的CRE报告基因单克隆细胞株功...

【专利技术属性】
技术研发人员：权利要求书一页说明书九页附图四页，
申请(专利权)人：上海精翰生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：