本发明专利技术涉及基于LuxR的生物传感器。其中包括感应模块和报告模块，所述感应模块是组成型表达LuxR蛋白的表达元件，所述报告模块包括由启动子Plux可操作连接的报告基因组成。在检测过程中，如果样品中存在3OC6‑HSL，其与LuxR蛋白特异性的结合形成复合物，激活Plux启动子，启动报告基因的表达。本发明专利技术的生物感应器对于例如鼠疫耶尔森菌产生的信号分子3OC6‑HSL具有较高的灵敏度，因此可以用于检测这些病菌，具有灵敏度高，检测准确的优点，具有较高的价值。
【技术实现步骤摘要】
基于细菌群体密度感应蛋白LuxR的生物传感器及其应用
本专利技术属于医药生物
，具体涉及病原菌的检测，更具体涉及细菌群体密度感应蛋白LuxR的生物传感器及其应用。
技术介绍
群体感应(Quorumsensing，QS)是一种涉及细胞外信号分子的细胞间通信机制，细菌利用这些信号分子来协调集体行为[1,2]。在革兰氏阴性细菌中，酰基高丝氨酸内酯(Acyl-HSLs)是介导QS的信号分子[3]。酰基高丝氨酸内酯由LuxI蛋白家族成员合成，穿过细菌细胞壁运输，并被LuxR家族传感器蛋白识别[4,5]。费氏弧菌(Vibriofischeri)LuxR是3-氧代己酰基-高丝氨酸内酯(3-oxo-hexanoyl-homoserinelactone，3OC6-HSL)的转录激活因子。LuxI/LuxRQS系统已被生物工程师用于构建细菌感应器[6]、人工细菌菌群[7]和种群同步器[8]，这类器件需要高可靠性、高灵敏度和高可调性，通过探索系统工程方法以满足这些需求具有重要意义。此外，为了获得更好的效果，可通过定向进化与随机突变相结合，鉴定能够强烈影响LuxR信号特异性的位点[9-11]。然而，由于其固有的随机输出和耗时性，定向进化在探索蛋白质序列和功能之间关系的能力上受到限制，这阻碍了更多LuxR的信号特异性位点的搜寻。。基于结构的分子动力学(moleculardynamics，MD)模拟[12,13]也被用于确定对3OC6-HSL与LuxR亲和力至关重要的位点[14-16]，但在这种情况下，实际产生的蛋白质可能不具有应用性或不适合用于后续的生化验证。参考文献：[1]AtkinsonS,WilliamsP.Quorumsensingandsocialnetworkinginthemicrobialworld[J].JRSocInterface,2009,6(40):959-978.[2]BasslerBL,LosickR.Bacteriallyspeaking[J].Cell,2006,125(2):237-246.[3]ChurchillME,ChenL.Structuralbasisofacyl-homoserinelactone-dependentsignaling[J].ChemRev,2011,111(1):68-85.[4]EglandKA,GreenbergEP.QuorumsensinginVibriofischeri:elementsoftheluxlpromoter[J].MolMicrobiol,1999,31(4):1197-1204.[5]FuquaC,ParsekMR,GreenbergEP.Regulationofgeneexpressionbycell-to-cellcommunication:acyl-homoserinelactonequorumsensing[J].AnnuRevGenet,2001,35:439-468.[6]SteindlerL,VenturiV.Detectionofquorum-sensingN-acylhomoserinelactonesignalmoleculesbybacterialbiosensors[J].FEMSMicrobiolLett,2007,266(1):1-9.[7]DaninoT,Mondragón-PalominoO,TsimringL,etal.Asynchronizedquorumofgeneticclocks[J].Nature,2010,463(7279):326-330.[8]CollinsCH,LeadbetterJR,ArnoldFH.Dualselectionenhancesthesignalingspecificityofavariantofthequorum-sensingtranscriptionalactivatorLuxR[J].NatBiotechnol,2006,24(6):708-712.[9]ChaiY,WinansSC.Site-directedmutagenesisofaLuxR-typequorum-sensingtranscriptionfactor:alterationofautoinducerspecificity[J].MolMicrobiol,2004,51(3):765-776.[10]HawkinsAC,ArnoldFH,StuermerR,etal.DirectedevolutionofVibriofischeriLuxRforimprovedresponsetobutanoyl-homoserinelactone[J].ApplEnvironMicrobiol,2007,73(18):5775-5781.[11]RajputA,KumarM.ComputationalExplorationofPutativeLuxRSolosinArchaeaandTheirFunctionalImplicationsinQuorumSensing[J].FrontMicrobiol,2017,8:798.[12]GhanakotaP,CarlsonHA.DrivingStructure-BasedDrugDiscoverythroughCosolventMolecularDynamics[J].JMedChem,2016,59(23):10383-10399.[13]Rodriguez-BusseyIG,DoshiU,HamelbergD.Enhancedmoleculardynamicssamplingofdrugtargetconformations[J].Biopolymers,2016,105(1):35-42.[14]CollinsCH,ArnoldFH,LeadbetterJR.DirectedevolutionofVibriofischeriLuxRforincreasedsensitivitytoabroadspectrumofacyl-homoserinelactones[J].MolMicrobiol,2005,55(3):712-723.[15]KviatkovskiI,YarnitzkyT,ShushanS,etal.AbacterialbiosensorencodingageneticallymodifiedLuxRreceptorexhibitsimproveddetectionofPseudomonasaeruginosa'sbiomarkermolecule2-aminoacetophenone[J].ChemCommun(Camb),2018,54(66):9218-9221.[16]TashiroY,KimuraY,FurubayashiM,etal.DirectedevolutionoftheautoinducerselectivityofVibrio本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种基于LuxR的生物传感器，其特征在于，包括感应模块和报告模块，所述感应模块是组成型表达LuxR蛋白的表达元件，所述报告模块包括由启动子Pluxs可操作连接的报告基因组成。/n
【技术特征摘要】
1.一种基于LuxR的生物传感器，其特征在于，包括感应模块和报告模块，所述感应模块是组成型表达LuxR蛋白的表达元件，所述报告模块包括由启动子Pluxs可操作连接的报告基因组成。
2.如权利要求1所述的生物传感器，其特征在于，所述LuxR蛋白是野生型或突变型，所述野生型的LuxR蛋白具有SEQIDNO.2所示氨基酸序列；所述突变型是指LuxR蛋白的L42、I46、I58、Y62、W66、D70和D79位点突变，优选地，突变型是指I46F，D79E，W66H，W66R，W66K，Y62R，A44I，A44L，A44V，更优选地的是I46突变为F，更具体的氨基酸序列如SEQIDNO.4所示。
3.如权利要求1所述的生物传感器，其特征在于，所述报告基因是荧光蛋白，例如绿色荧光蛋白、红色荧光蛋白、黄色荧光蛋白及其突变体；荧光素酶，例如细菌荧光素酶、萤火虫荧光素酶和Renilla荧光素酶；β半乳糖苷酶；二氢叶酸还原酶；分泌型碱性磷酸酶；抗生素抗性基因，例如氨苄青霉素、卡那霉素、四环素对应抗性基因。
4.如权利要求1所述的生物传感器，其特征在于，所述感应模块和报告模块位于同一载体上，或者分别位于不同的载体上。
5.如权利要求1所述的生物传感器，其特征在于，所述感应模块由组成型启动子Pcon，位于LuxR基因的上游的RBS，及可操作连接的LuxR蛋白质编码基因；所述报告模块由启动子Plux，RBS和报告基因构成。
6.如权利要求5所述的生物传感器，其特征在于，所述Plux序列如SEQIDNO.4所示；更优选地，所述传感器的完整核苷酸序列如SEQIDNO.7所示。
7.含...
【专利技术属性】
技术研发人员：滕越，刘芮存，宋亚军，崔玉军，李金玉，陈雨露，
申请(专利权)人：中国人民解放军军事科学院军事医学研究院，
类型：发明
国别省市：北京;11
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