一种非洲猪瘟病毒p72重组蛋白及其构建的胶体金免疫层析试纸制造技术

本发明专利技术属于病毒疫病诊断及动物检疫领域，具体涉及一种非洲猪瘟病毒p72重组蛋白，进一步公开一种基于该重组蛋白构建的胶体金免疫层析试纸，以及检测非洲猪瘟病毒抗体的方法。本发明专利技术所述基于非洲猪瘟病毒p72蛋白双抗原夹心的胶体金试纸，用胶体金标记ASFV强免疫原性主要结构蛋白p72的重组抗原，以双抗原夹心的方式进行猪血清中ASFV抗体的检测。本发明专利技术所述双抗原夹心的胶体金免疫层析试纸，样品采集后只需与样品稀释液按一定比例混合后滴加至样品孔中，5min就可以出检测结果，且结果准确，并能直接用于检测可疑猪血清中的病毒抗体，特别适合现场ASFV血清学诊断、流行病学调查和生猪国际贸易检疫检验。

【技术实现步骤摘要】
一种非洲猪瘟病毒p72重组蛋白及其构建的胶体金免疫层析试纸
本专利技术属于病毒疫病诊断及动物检疫领域，具体涉及一种非洲猪瘟病毒p72重组蛋白，进一步公开一种基于该重组蛋白构建的胶体金免疫层析试纸，以及检测非洲猪瘟病毒抗体的方法。
技术介绍
非洲猪瘟(ASF)是由非洲猪瘟病毒(ASFV)引起的感染家猪和各种野猪的高度接触性、致死性传染病，其发病率和死亡率均可高达100％，被世界动物卫生组织(OIE)列为法定报告动物疫病，更被我国列为一类动物疫病。该病主要的临床症状为高热、内脏器官广泛性出血、呼吸系统和神经系统功能紊乱。ASFV首次于1921年在肯尼亚被发现，随后传播到格鲁吉亚、亚美尼亚、阿塞拜疆和俄罗斯等邻国，并于2018年传入我国，对我国养猪业造成了巨大的危害，目前尚无有效的疫苗或抗病毒药物用于防控非洲猪瘟。因此，如何实现在临床上快速诊断非洲猪瘟病毒感染，建立特异性强、敏感性高、操作简单、适合非疫区国家(地区)使用的ASFV检测体系及方法，对于ASFV血清学诊断、流行病学调查和生猪国际贸易检疫检验领域均具有积极的意义。ASFV属于非洲猪瘟病毒科非洲猪瘟病毒属的重要成员，是目前唯一已知的虫媒DNA病毒，ASFV的中间宿主为钝缘蜱，是其主要的传播媒介。经研究报道，ASFV病毒的生物学特性类似于虹彩病毒科和痘病毒科病毒，该病毒基因组为双股线性DNA，大小约为170-190kb，编码150-170种蛋白，其中包括结构蛋白60-70种，诸如目前研究报道较多的p72蛋白、p30蛋白、p54蛋白、CD2v蛋白、p62蛋白等；此外，该病毒粒子呈20面体对称结构，具有直径大小约为180-220nm的囊膜。ASFV主要感染猪的网状内皮细胞和单核巨噬细胞，健康猪与患病猪或污染物直接接触是非洲猪瘟病毒最主要的传播途径。ASFV编码蛋白中，p72蛋白是由B646L基因编码，占病毒质量的31％-33％，是病毒最为丰富的一种结构蛋白，其蛋白保守且位于病毒粒子最外层，是病毒主要的核衣壳蛋白，也是病毒最主要的抗原之一，可在感染猪体内产生大量的中和抗体，适用于临床的检测。据研究，p72蛋白产生时间主要为病毒感染后晚期，且根据B646L基因序列的不同，现有技术中将ASFV共分为24个基因型。此外，p72在核苷酸水平上虽然存在差异，但是在氨基酸水平上却相对保守，因此，p72蛋白适合用于临床对非洲猪瘟病毒诊断方法的建立。由于目前尚无有效的疫苗和抗病毒药物用于ASF的防控，因此，建立快速、准确的诊断方法对控制该病的传播和降低经济损失具有至关重要的作用。根据世界动物卫生组织(OIE)的推荐，目前ASF的诊断技术主要包括病原鉴定和血清学试验。在病原鉴定技术中，鉴于ASFV具有血凝特性，血细胞吸附试验(Hemadsorption，HAD)是鉴定ASFV感染的经典方法之一，并具有较高敏感性。但是，该检测方法中需要制备和培养猪骨髓细胞，不仅费时费力、操作不便，而且不能用于不具有血细胞吸附特性的ASFV毒株的诊断。免疫组化试验(IHC)可用于检测可疑病猪组织器官中ASFV抗原，该方法采用ASFV特定抗体与抗原结合后与底物作用显色，从而标记ASFV抗原存在的区域，适用于所有ASFV毒株，且可以对临床样品其他病毒的感染进行鉴别诊断，但是，该方法则存在操作步骤繁琐及耗时长的问题，且由于要接触病毒，因此需要在专门的P3实验室进行操作，增加了检测难度和要求。此外，聚合酶链式反应(PCR)、实时定量PCR、重组酶介导链替换核酸扩增(RAA)技术和环介导等温扩增(LAMP)技术因具有高灵敏度、检测快速、结果准确等优点，也已成为现有技术中诊断ASFV的重要技术手段之一，但却均需要较昂贵的仪器设备支持，且存在容易污染的缺点，需要重复操作和序列测定等方法进行验证。另外，动物接种试验也是诊断ASFV感染的经典方法之一，但却存在周期长、费用高、易散毒的缺陷。在血清学检测技术中，酶联免疫吸附试验(ELISA)和间接免疫荧光试验(IFA)是最常用的检测方法。ELISA方法具有灵敏度高、操作简便、结果准确等优点，已被OIE规定为国际贸易检验方法之一，法国和西班牙已有商品化的试剂盒供应，但是，ELISA方法需要包被抗原(全病毒或者是重组蛋白)，而包被全病毒则存在散毒的风险，包被重组蛋白也存在制备难度大、供应有限、价格昂贵、易漏检等缺点，有待于进一步研发改进。IFA试验需要制备肺泡巨噬细胞用于病毒的培养，存在成本昂贵、操作复杂和散毒的风险，因此IFA试验检测血清中的ASFV抗体的方法并不常用，通常仅作为检测标准使用。胶体金免疫层析技术相比于RT-PCR、ELISA等常规技术，由于其具有操作简单、检测灵敏度高、特异性好、易保存、检测稳定、综合成本低、受外界因素影响小等优点，可适用于野外和现场诊断、基层单位使用，在近年来得到快速的发展。然而，目前用于ASFV诊断的胶体金试纸条的报道和商品则较少。
技术实现思路
为此，本专利技术所要解决的技术问题在于提供一种非洲猪瘟病毒p72重组蛋白，该重组蛋白适宜于胶体金免疫层析检测体系的构建；本专利技术所要解决的第二个技术问题在于提供一种可用于检测非洲猪瘟病毒的胶体金免疫层析试纸，具有特异性强、敏感性好、重复率高、检测结果准确的优势，适用于临床样品的快速检测；本专利技术所要解决的第三个技术问题在于提供一种基于所述胶体金免疫层析试纸进行非洲猪瘟病毒检测的方法。为解决上述技术问题，本专利技术所述的一种非洲猪瘟病毒p72重组蛋白的构建方法，包括如下步骤：(1)以非洲猪瘟病毒ASFV-SY18序列为模板合成p72基因片段，并设计如下引物进行p72基因的扩增，扩增产物经凝胶电泳后进行胶回收：上游引物：5’-GAGCTCGGTACCCTCGAGTTAGGTACTGTAACGCAG-3’；下游引物：5’-CTGCAGGTCGACAAGCTTTCAATGGCATCAGGAGGAGCT-3’；(2)选择XhoI和HindIII限制性内切酶进行酶切pColdTFDNA质粒以使其线性化，并将步骤(1)中收集的扩增产物使用VazymeexnaseII同源重组酶同源重组至线性化的pColdTFDNA载体上，构建得到重组质粒；(3)将重组质粒转化至BL21感受态细胞中，筛选出阳性克隆，并进行p72重组蛋白的表达及纯化，即得。具体的，所述步骤(1)中，所述非洲猪瘟病毒ASFV-SY18序列的GenBank收录号为MH766894。本专利技术还公开了由所述方法构建得到的非洲猪瘟病毒p72重组蛋白。本专利技术还公开了所述非洲猪瘟病毒p72重组蛋白用于制备检测非洲猪瘟病毒的胶体金免疫层析试纸的用途。本专利技术还公开了一种检测非洲猪瘟病毒的胶体金免疫层析试纸，包括底板和外壳，所述底板上依次固定有吸水滤纸、固相硝酸纤维素膜、金标垫和样品垫；所述金标垫吸附的金标抗原包括胶体金标记的p72重组蛋白和胶体金标记的鸡IgY抗体；所述固相硝酸纤维素膜表面划有检测线和质控线，所述检测线为所述p72重组蛋白，所述本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种非洲猪瘟病毒p72重组蛋白的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：/n(1)以非洲猪瘟病毒ASFV-SY18序列为模板合成p72基因片段，并设计如下引物进行p72基因的扩增，扩增产物经凝胶电泳后进行胶回收：/n上游引物：5’-GAGCTCGGTACCCTCGAGTTAGGTACTGTAACGCAG-3’；/n下游引物：5’-CTGCAGGTCGACAAGCTTTCAATGGCATCAGGAGGAGCT-3’；/n(2)选择XhoI和HindIII限制性内切酶进行酶切pCold TF DNA质粒以使其线性化，并将步骤(1)中收集的扩增产物使用Vazyme exnase II同源重组酶同源重组至线性化的pColdTF DNA载体上，构建得到重组质粒；/n(3)将重组质粒转化至BL21感受态细胞中，筛选出阳性克隆，并进行p72重组蛋白的表达及纯化，即得。/n

【技术特征摘要】
1.一种非洲猪瘟病毒p72重组蛋白的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)以非洲猪瘟病毒ASFV-SY18序列为模板合成p72基因片段，并设计如下引物进行p72基因的扩增，扩增产物经凝胶电泳后进行胶回收：
上游引物：5’-GAGCTCGGTACCCTCGAGTTAGGTACTGTAACGCAG-3’；
下游引物：5’-CTGCAGGTCGACAAGCTTTCAATGGCATCAGGAGGAGCT-3’；
(2)选择XhoI和HindIII限制性内切酶进行酶切pColdTFDNA质粒以使其线性化，并将步骤(1)中收集的扩增产物使用VazymeexnaseII同源重组酶同源重组至线性化的pColdTFDNA载体上，构建得到重组质粒；
(3)将重组质粒转化至BL21感受态细胞中，筛选出阳性克隆，并进行p72重组蛋白的表达及纯化，即得。


2.根据权利要求1所述非洲猪瘟病毒p72重组蛋白的构建方法，其特征在于，所述步骤(1)中，所述非洲猪瘟病毒ASFV-SY18序列的GenBank收录号为MH766894。


3.由权利要求1或2所述方法构建得到的非洲猪瘟病毒p72重组蛋白。


4.权利要求3所述非洲猪瘟病毒p72重组蛋白用于制备检测非洲猪瘟病毒的胶体金免疫层析试纸的用途。


5.一种检测非洲猪瘟病毒的胶体金免疫层析试纸，其特征在于，包括底板和外壳，所述底板上依次固定有吸水滤纸、固相硝酸纤维素膜、金标垫和样品垫；
所述金标垫吸附的金标抗原包括胶体金标记的p72重组蛋白和胶体金标记的鸡IgY抗体；
所述固相硝酸纤维素膜表面划有检测线和质控线，所述检测线为所述p72重组蛋白，所述质控线为山羊抗鸡IgY抗体。


6.根据权利要求5所述检测非洲猪瘟病毒的胶体金免疫层析试纸，其特征在于，所述金标抗原的制备方法包括分别制备所述胶体金标记...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨汉春，周信荣，赵全红，章健，李明伟，周磊，盖新娜，韩军，张桂红，
申请(专利权)人：中国农业大学，
类型：发明
国别省市：北京;11