一种深海古菌单链DNA结合蛋白SSB及其制备方法和应用技术

本发明专利技术提出了一种深海古菌单链DNA结合蛋白SSB及其制备方法和应用，属于基因工程技术领域，包括以下步骤：S1.构建深海古菌单链DNA结合蛋白SSB的重组表达质粒S2.重组表达深海古菌单链DNA结合蛋白SSB；S3.亲和纯化深海古菌单链DNA结合蛋白SSB；S4.凝胶电泳实验检测深海古菌单链DNA结合蛋白SSB的单链DNA结合活性。本发明专利技术采用基因合成一种深海古菌单链DNA结合蛋白SSB，应用于DNA延伸与PCR反应，提高PCR特异性，减弱引物二聚体的生成，提高PCR目的基因的扩增效果，能提高PCR扩增产量1‑2倍。

【技术实现步骤摘要】
一种深海古菌单链DNA结合蛋白SSB及其制备方法和应用
本专利技术涉及基因工程
，具体涉及一种深海古菌单链DNA结合蛋白SSB及其制备方法和应用。
技术介绍
DNA修饰酶在核酸检测与分子诊断中有着重要应用。目前聚合酶链式反应(PolymeraseChainReaction,以下简称为PCR)技术广泛应用于各种核酸扩增与检测领域，极大地促进了核酸诊断技术、现代基因工程、重组蛋白质工程的发展。PCR过程会出现引物二聚体，从而降低了PCR的扩增产量和产物特异性，还会造成荧光法检测核酸的假阳性信号。改善PCR性能的技术主要包括优化PCR反应体系组分，例如通过加入二甲基亚砜(DMSO)、优化镁离子浓度等。目前这些技术并不能有效解决引物二聚体的问题。作为PCR技术的核心试剂，DNA聚合酶活性的调控与改良是PCR的核心。热启动DNA聚合酶常常用来消除引物二聚体的产生。热启动DNA聚合酶在低温下没有活性，只有95度热激活后才能释放出DNA聚合酶活性，从而消除DNA聚合酶在常温下延伸引物二聚体的缺点。然而某些引物二聚体在PCR退火温度下仍能够保持稳定的双链结构，导致DNA聚合酶无法完全消除引物二聚体非特异性扩增的缺陷。消除引物二聚体的另一种策略是将引物单链DNA保护起来，使其不能够彼此形成引物二聚体，从而也就不能够被DNA聚合酶延伸成长的引物二聚体。目前采用的策略通常是加入单链DNA结合蛋白。然而普通单链DNA结合蛋白结合单链DNA的活性较低，需要利用大量的单链DNA结合蛋白。CN103820415B公开了一种热启动DNA聚合酶的制备方法，包括如下步骤：获得单链DNA结合蛋白、TaqDNA聚合酶单克隆抗体以及TaqDNA聚合酶；将所述单链DNA结合蛋白、所述TaqDNA聚合酶单克隆抗体以及所述TaqDNA聚合酶组分按照比例混合；所述单链DNA结合蛋白、所述TaqDNA聚合酶单克隆抗体以及所述TaqDNA聚合酶的含量分别都为20～40％，本专利技术还涉及由以上方法制备的热启动DNA聚合酶及其使用方法。本专利技术制备的热启动DNA聚合酶还可以解决热启动PCR技术中容易出现的DNA损伤、产物污染、封闭不完全导致热启动效果不好的问题。但是，本专利需要以单链DNA结合蛋白为原料，无法解决新型单链DNA结合蛋白的制备问题。CN106701738B公开了一种等温解开双链DNA的方法以及基于该方法制备单链DNA的方法。等温解开双链DNA的技术方案为利用重组酶结合单链DNA探针形成复合物，复合物识别双链DNA中与单链DNA探针同源的序列并侵入双链DNA，从而实现双链DNA的等温开链，随后单链DNA探针和双链中一条链互补配对，而单链结合蛋白结合另一条链稳定开链结构。基于该方案及单链DNA探针3’-末端可以被连接酶和聚合酶等酶识别的特性，本专利技术还提出了制备单链DNA的方案，并详细介绍了通过连接酶或延伸酶制备单链DNA的方案。以上技术方案均可在等温条件下完成，且无需ATP循环系统，甚至ATP可被dATP替代，所用酶来源广泛、易于获得，为等温技术以双链DNA作为研究对象提供了一个通用平台。但是该方法条件较为苛刻，制备方法难度较大。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提出一种深海古菌单链DNA结合蛋白SSB及其制备方法和应用，本专利技术制得的深海古菌单链DNA结合蛋白SSB具有单链DNA结合力高、热稳定性较高等特点，用于PCR和等温核酸扩增反应，能显著降低多种商品化DNA聚合酶的PCR扩增目的基因时引物二聚体的产生，提高扩增产量。本专利技术的技术方案是这样实现的：本专利技术提供一种深海古菌单链DNA结合蛋白SSB的制备方法，包括以下步骤：S1.构建深海古菌单链DNA结合蛋白SSB的重组表达质粒；S2.重组表达深海古菌单链DNA结合蛋白SSB；S3.亲和纯化深海古菌单链DNA结合蛋白SSB；S4.凝胶电泳实验检测深海古菌单链DNA结合蛋白SSB的单链DNA结合活性。作为本专利技术的进一步改进，具体包括以下步骤：S1.构建深海古菌单链DNA结合蛋白SSB的重组表达质粒：基于深海热液微生物样本的宏基因组信息和深海古菌单链DNA结合蛋白SSB基因序列，进行蛋白活性位点改造，并优化改造后的深海古菌单链DNA结合蛋白SSB的稀有密码子，采用全基因合成技术合成深海古菌单链DNA结合蛋白SSB基因，并将该基因克隆到原核表达载体中，构建深海古菌单链DNA结合蛋白SSB重组表达质粒；S2.重组表达深海古菌单链DNA结合蛋白SSB：将构建的深海古菌单链DNA结合蛋白SSB重组表达质粒转化到宿主中，得到深海古菌单链DNA结合蛋白SSB重组表达菌株；再利用诱导剂启动深海古菌单链DNA结合蛋白SSB的诱导表达；S3.亲和纯化深海古菌单链DNA结合蛋白SSB：将表达了深海古菌单链DNA结合蛋白SSB的菌体，重悬于非变性蛋白裂解液，超声波破碎菌体，离心收集深海古菌单链DNA结合蛋白SSB的大肠杆菌裂解上清液；再利用固定化镍离子亲和色谱获得电泳纯的深海古菌单链DNA结合蛋白SSB；S4.凝胶电泳实验检测深海古菌单链DNA结合蛋白SSB的单链DNA结合活性：将不同浓度的深海古菌单链DNA结合蛋白SSB与荧光标记的单链DNA，保温处理，利用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，检测其结合单链DNA的能力。作为本专利技术的进一步改进，步骤S1中所述原核表达载体为pET28或其它原核表达载体。作为本专利技术的进一步改进，步骤S2中所述宿主为大肠杆菌表达宿主BL21(DE3)、BL21(DE3)pLySs中的至少一种。作为本专利技术的进一步改进，步骤S2中所述诱导剂为IPTG。作为本专利技术的进一步改进，所述的利用诱导剂IPTG启动深海古菌单链DNA结合蛋白SSB的诱导表达的具体条件为：先将深海古菌单链DNA结合蛋白SSB重组表达菌株培养至OD600＝0.6-1.0，再加入0.02-1mmol/L诱导剂IPTG培养，进行诱导表达。作为本专利技术的进一步改进，所述培养条件为25-37℃温度下培养3-6h或12-25℃温度下培养12-24h。作为本专利技术的进一步改进，步骤S4中所述保温处理条件为25-37℃保温5-30min。本专利技术进一步保护一种上述的制备方法制得的深海古菌单链DNA结合蛋白SSB，所述深海古菌单链DNA结合蛋白SSB蛋白序列如SEQIDNO.1所示。本专利技术进一步保护上述深海古菌单链DNA结合蛋白SSB的应用，所述应用包括PCR制备DNA聚合酶和LAMP等温核酸扩增反应。作为本专利技术的进一步改进，所述DNA聚合酶包括TaqDNA聚合酶、KODDNA聚合酶、BstDNA聚合酶。为了提高单链DNA结合蛋白对单链DNA的结合能力，本专利技术从深海微生物宏基因组中筛选到了一种新型的单链DNA结合蛋白——深海古菌单链DNA结合蛋白SSB。利用重组蛋白诱导表达技术，制备本专利技术中的深海古菌单链DNA结合蛋白SSB。本专利技术的SSB蛋白结合单链DNA的活性非常本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种深海古菌单链DNA结合蛋白SSB的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：/nS1.构建深海古菌单链DNA结合蛋白SSB的重组表达质粒；/nS2.重组表达深海古菌单链DNA结合蛋白SSB；/nS3.亲和纯化深海古菌单链DNA结合蛋白SSB；/nS4.凝胶电泳实验检测深海古菌单链DNA结合蛋白SSB的单链DNA结合活性。/n

【技术特征摘要】
1.一种深海古菌单链DNA结合蛋白SSB的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1.构建深海古菌单链DNA结合蛋白SSB的重组表达质粒；
S2.重组表达深海古菌单链DNA结合蛋白SSB；
S3.亲和纯化深海古菌单链DNA结合蛋白SSB；
S4.凝胶电泳实验检测深海古菌单链DNA结合蛋白SSB的单链DNA结合活性。


2.根据权利要求1所述深海古菌单链DNA结合蛋白SSB的制备方法，其特征在于，具体包括以下步骤：
S1.构建深海古菌单链DNA结合蛋白SSB的重组表达质粒：
基于深海热液微生物样本的宏基因组信息和深海古菌单链DNA结合蛋白SSB基因序列，进行蛋白活性位点改造，并优化改造后的深海古菌单链DNA结合蛋白SSB的稀有密码子，采用全基因合成技术合成深海古菌单链DNA结合蛋白SSB基因，并将该基因克隆到原核表达载体中，构建深海古菌单链DNA结合蛋白SSB重组表达质粒；
S2.重组表达深海古菌单链DNA结合蛋白SSB：
将构建的深海古菌单链DNA结合蛋白SSB重组表达质粒转化到宿主中，得到深海古菌单链DNA结合蛋白SSB重组表达菌株；再利用诱导剂启动深海古菌单链DNA结合蛋白SSB的诱导表达；
S3.亲和纯化深海古菌单链DNA结合蛋白SSB：
将表达了深海古菌单链DNA结合蛋白SSB的菌体，重悬于非变性蛋白裂解液，超声波破碎菌体，离心收集深海古菌单链DNA结合蛋白SSB的大肠杆菌裂解上清液；再利用固定化镍离子亲和色谱获得电泳纯的深海古菌单链DNA结合蛋白SSB；
S4.凝胶电泳实验检测深海古菌单链DNA结合蛋白SSB的单链DNA结合活性：
将不同浓度的深海古菌单链DNA结合蛋白SSB与荧光标记的单链DNA，保温处理，利用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，检测其结合单链DNA的能力。


3.根据权利要求2所...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘喜朋，翁妍，王风平，
申请(专利权)人：上海交通大学，中国大洋矿产资源研究开发协会中国大洋事务管理局，
类型：发明
国别省市：上海;31