一种利用无细胞体系高效合成番茄红素的方法技术

本发明专利技术公开了一种利用无细胞体系高效合成番茄红素的方法，首先构建番茄红素合成途径关键酶GGPPS、PSY、PDS的重组质粒，基于CFPS体系表达GGPPS、PSY、PDS，或基于富含GGPPS、PSY、PDS的大肠杆菌细胞裂解液，人工外源添加合成反应所需的底物、能量和辅因子等，在体外高效合成番茄红素。本发明专利技术首次将无细胞体系应用于体外合成番茄红素中，该方法缩短了底物传递距离，提高了反应速率和催化效率；操作简单、稳定性强，反应条件精确易控；副反应少、生产速率较高，底物得率接近理论值，而且能够方便快捷地检测番茄红素，适合检测与验证。

A method for efficient synthesis of lycopene using cell-free system

【技术实现步骤摘要】
一种利用无细胞体系高效合成番茄红素的方法
本专利技术属于生物
，具体涉及一种利用无细胞体系高效合成番茄红素的方法。
技术介绍
番茄红素是一种天然类胡萝卜素，属于类异戊二烯类烯萜类化合物，由于其高抗氧化性以及在冠状病、前列腺癌等疾病中有良好的抑制作用，被广泛应用于药剂、食品、医疗以及保健品等行业中。类似于番茄红素这样的复杂萜类化合物，都是由一系列的酶参与、多酶协同催化反应合成。现阶段随着基因工程技术的迅速发展，以及代谢工程和合成生物学方法的引入，人们越来越关注利用微生物发酵法生产番茄红素。微生物发酵法安全无毒，并能解决番茄红素产量和产率低、提取成本高等一系列问题。但是在微生物细胞中人工设计生物合成途径进行异源多酶级联反应往往会受到多种因素限制：首先在细胞中需要进行代谢通路的平衡和多基因调控，耗费时间长且繁琐；其次细胞宿主本身代谢具有复杂性，高浓度中间代谢物或具有毒性的终产物都会对细胞产生抑制作用；最后，人工合成的生物元件与宿主的兼容适配性低，支路途径的副产物会导致目标产品的低产量和低产率等。
技术实现思路
针对现有技术的不足，本专利技术提供一种利用无细胞体系高效合成番茄红素的方法，针对番茄红素的多酶合成体系，将无细胞合成体系引入到其中，可建立起解决生物大分子代谢途径构建和调控问题的一种新的研究策略，摒弃了传统复杂的体内基因改造以及细胞内各种环境干扰的负面因素，使得在体外就可以对反应微环境进行优化，具有很强的应用价值。本专利技术是通过以下技术方案实现的：一种利用无细胞体系高效合成番茄红素的方法，包括以下步骤：步骤1)番茄红素关键酶重组质粒的构建：以含有GGPPS、PSY、PDS基因的重组质粒pET-EBI为模板对下列引物分别进行PCR，分别得到片段crtE-His、crtB-His、crtI-His，胶回收后使用限制性内切酶NdeI/XhoI对PCR片段和原核表达质粒pET22b进行双酶切，将之分别连接到质粒pET22b上，获得重组质粒pET22b-crtE-His、pET22b-crtB-His、pET22b-crtI-His；pET22b-crtE-His引物设计：crtE-HisF具有如SEQIDNO.1所示的核苷酸序列，NdeI酶切位点；crtE-HisR具有如SEQIDNO.2所示的核苷酸序列，XhoI酶切位点；pET22b-crtB-His引物设计：crtB-HisF具有如SEQIDNO.3所示的核苷酸序列，NdeI酶切位点；crtB-HisR具有如SEQIDNO.4所示的核苷酸序列，XhoI酶切位点；pET22b-crtI-His引物设计：crtI-HisF具有如SEQIDNO.5所示的核苷酸序列，NdeI酶切位点；crtI-HisR具有如SEQIDNO.6所示的核苷酸序列，XhoI酶切位点；步骤2)基于无细胞蛋白质合成体系的番茄红素合成方法：利用优化型非透析式大肠杆菌无细胞重组蛋白表达试剂盒进行表达，通过外源添加合成关键酶的重组质粒pET22b-crtE-His、pET22b-crtB-His、pET22b-crtI-His，在体外分别合成关键酶GGPPS、PSY、PDS，检测总蛋白浓度并通过SDS-PAGE检测蛋白表达占比情况；合成关键酶的反应完成后，在含有100mMTris-HCL缓冲体系中加入金属离子、辅因子以及关键酶反应液，随后添加底物以开始合成番茄红素的反应，即得；步骤3)基于裂解液的番茄红素合成方法：培养含有重组质粒pET22b-crtE-His、pET22b-crtB-His、pET22b-crtI-His的大肠杆菌，使编码GGPPS、PSY、PDS的基因获得过量表达；收集细胞，通过低温高压匀浆仪在4℃、20000psi条件下单次破碎细胞，在4℃、12000rpm下离心30min后获得细胞裂解液；在含有100mMTris-HCL缓冲体系中添加底物、金属离子、辅因子，随后添加富含关键酶的细胞裂解液以开始合成番茄红素的反应，即得。优选地，步骤1)所述GGPPS、PSY、PDS基因序列均来源于DeinococcuswulumuqiensisR12菌株，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC1.8884。优选地，步骤2)所述重组蛋白表达的温度为18～30℃，时间为4～10h。优选地，步骤2)所述金属离子为Mg2+、K+、NH4+；所述辅因子为CoA、NAD、ATP；所述底物为FPP、IPP，浓度均为4μM；所述关键酶反应液中GGPPS、PSY、PDS的浓度比例为1:1:1。优选地，步骤2)所述合成番茄红素的反应的温度为25～35℃，时间为10～20h。优选地，步骤3)所述大肠杆菌为BL21(DE3)。优选地，步骤3)所述底物为FPP与IPP，浓度均为10μM～0.5mM；所述金属离子为Mg2+、K+、NH4+；所述辅因子为CoA、NAD、ATP，浓度均为0～1mM；所述细胞裂解液中GGPPS、PSY、PDS的浓度比例为1～2:1～2:1～2。优选地，所述底物的浓度均为0.3mM；所述辅因子的浓度均为0mM；所述细胞裂解液中GGPPS、PSY、PDS的浓度比例为1:2:2。优选地，步骤3)所述合成番茄红素的反应的温度为25～35℃，时间为10～15h。优选地，所述合成番茄红素的反应的温度为30℃。本专利技术的有益效果如下：本专利技术首次将无细胞自组装体系利用到体外合成番茄红素中，该方法缩短了底物传递距离，提高了反应速率和催化效率，强化了蛋白的稳定性。不仅探讨出番茄红素合成过程中关键酶之间的最适酶比，而且操作简单、稳定性强，为进一步优化番茄红素合成奠定了基础。附图说明图1为实施例1中菌落PCR(a)及双酶切检测结果(b)；图2为实施例1中GGPPS、PSY、PDS的蛋白表达结果；图3为实施例2中CFPS蛋白表达结果；图4为实施例2的CFPS无细胞合成体系中番茄红素产量随时间的变化结果；图5为实施例3的裂解液无细胞合成体系中番茄红素产量随时间的变化结果；图6为实施例2和实施例3的番茄红素无细胞代谢工程示意图；图7为实施例4中酶比例对番茄红素合成的影响；图8为实施例4中底物浓度对番茄红素合成的影响；图9为实施例4中反应的温度对番茄红素合成的影响；图10为实施例4中辅因子CoA、NAD、ATP添加量对番茄红素合成的影响。具体实施方式以下结合附图与具体实施例对本专利技术的技术进行详细描述。应当知道的是，以下具体实施例仅用于帮助本领域技术人员理解本专利技术，而非对本专利技术的限制。实施例1番茄红素关键酶重组质粒的构建及表达1.含有牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶(GGPPS)、八氢番茄红素合成酶(PSY)、八氢番茄红素脱氢酶(PDS)基因的重组质粒的构建...

【技术保护点】
1.一种利用无细胞体系高效合成番茄红素的方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1)番茄红素关键酶重组质粒的构建：/n以含有GGPPS、PSY、PDS基因的重组质粒pET-EBI为模板对下列引物分别进行PCR，分别得到片段crtE-His、crtB-His、crtI-His，胶回收后使用限制性内切酶NdeI/XhoI对PCR片段和原核表达质粒pET22b进行双酶切，将之分别连接到质粒pET22b上，获得重组质粒pET22b-crtE-His、pET22b-crtB-His、pET22b-crtI-His；/npET22b-crtE-His引物设计：/ncrtE-His F具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，NdeI酶切位点；/ncrtE-His R具有如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列，XhoI酶切位点；/npET22b-crtB-His引物设计：/ncrtB-His F具有如SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列，NdeI酶切位点；/ncrtB-His R具有如SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列，XhoI酶切位点；/npET22b-crtI-His引物设计：/ncrtI-His F具有如SEQ ID NO.5所示的核苷酸序列，NdeI酶切位点；/ncrtI-His R具有如SEQ ID NO.6所示的核苷酸序列，XhoI酶切位点；/n步骤2)基于无细胞蛋白质合成体系的番茄红素合成方法：/n利用优化型非透析式大肠杆菌无细胞重组蛋白表达试剂盒进行表达，通过外源添加合成关键酶的重组质粒pET22b-crtE-His、pET22b-crtB-His、pET22b-crtI-His，在体外分别合成关键酶GGPPS、PSY、PDS，检测总蛋白浓度并通过SDS-PAGE检测蛋白表达占比情况；合成关键酶的反应完成后，在含有100mM Tris-HCL缓冲体系中加入金属离子、辅因子以及关键酶反应液，随后添加底物以开始合成番茄红素的反应，即得；/n步骤3)基于裂解液的番茄红素合成方法：/n培养含有重组质粒pET22b-crtE-His、pET22b-crtB-His、pET22b-crtI-His的大肠杆菌，使编码GGPPS、PSY、PDS的基因获得过量表达；收集细胞，通过低温高压匀浆仪在4℃、20000psi条件下单次破碎细胞，在4℃、12000rpm下离心30min后获得细胞裂解液；在含有100mM Tris-HCL缓冲体系中添加底物、金属离子、辅因子，随后添加富含关键酶的细胞裂解液以开始合成番茄红素的反应，即得。/n...

【技术特征摘要】
1.一种利用无细胞体系高效合成番茄红素的方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1)番茄红素关键酶重组质粒的构建：
以含有GGPPS、PSY、PDS基因的重组质粒pET-EBI为模板对下列引物分别进行PCR，分别得到片段crtE-His、crtB-His、crtI-His，胶回收后使用限制性内切酶NdeI/XhoI对PCR片段和原核表达质粒pET22b进行双酶切，将之分别连接到质粒pET22b上，获得重组质粒pET22b-crtE-His、pET22b-crtB-His、pET22b-crtI-His；
pET22b-crtE-His引物设计：
crtE-HisF具有如SEQIDNO.1所示的核苷酸序列，NdeI酶切位点；
crtE-HisR具有如SEQIDNO.2所示的核苷酸序列，XhoI酶切位点；
pET22b-crtB-His引物设计：
crtB-HisF具有如SEQIDNO.3所示的核苷酸序列，NdeI酶切位点；
crtB-HisR具有如SEQIDNO.4所示的核苷酸序列，XhoI酶切位点；
pET22b-crtI-His引物设计：
crtI-HisF具有如SEQIDNO.5所示的核苷酸序列，NdeI酶切位点；
crtI-HisR具有如SEQIDNO.6所示的核苷酸序列，XhoI酶切位点；
步骤2)基于无细胞蛋白质合成体系的番茄红素合成方法：
利用优化型非透析式大肠杆菌无细胞重组蛋白表达试剂盒进行表达，通过外源添加合成关键酶的重组质粒pET22b-crtE-His、pET22b-crtB-His、pET22b-crtI-His，在体外分别合成关键酶GGPPS、PSY、PDS，检测总蛋白浓度并通过SDS-PAGE检测蛋白表达占比情况；合成关键酶的反应完成后，在含有100mMTris-HCL缓冲体系中加入金属离子、辅因子以及关键酶反应液，随后添加底物以开始合成番茄红素的反应，即得；
步骤3)基于裂解液的番茄红素合成方法：
培养含有重组质粒pET22b-crtE-His、pET22b-crtB-His、pET22b-crtI-His的大肠杆菌，使编码GGPPS、PSY、PDS的基因获得过量表达；收集细胞，通过低温高压匀浆仪在4℃、20000psi条件下单次破碎细胞，在4℃、12000rpm下离心30min后获得细胞裂解液；在含有100mMTris-H...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐娴，刘洁，兰海全，顾万怡，杜邦绵，张志东，
申请(专利权)人：南京师范大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32