重组大肠杆菌系统及其构建方法和其在合成α-1,2-岩藻糖基化寡糖中的应用技术方案

涉及基因工程技术领域，提供了重组大肠杆菌系统及其构建方法和其在合成α‑1,2‑岩藻糖基化寡糖中的应用。该重组大肠杆菌系统具有α‑1,2‑岩藻糖基转移酶基因和GDP‑岩藻糖焦磷酸化酶基因。通过将α‑1,2‑岩藻糖基转移酶基因和GDP‑岩藻糖焦磷酸化酶基因转化到大肠杆菌中，构建基因工程菌，以表达α‑1,2‑岩藻糖基转移酶和GDP‑岩藻糖焦磷酸化酶，并将表达的α‑1,2‑岩藻糖基转移酶和GDP‑岩藻糖焦磷酸化酶用于酶法合成α‑1,2‑岩藻糖基化寡糖的。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】重组大肠杆菌系统及其构建方法和其在合成α-1,2-岩藻糖基化寡糖中的应用
本专利技术涉及基因工程
，具体涉及重组大肠杆菌系统、构建该重组大肠杆菌系统的方法，该重组大肠杆菌系统在合成α-1,2-岩藻糖基化寡糖中的应用以及一种α-1,2-岩藻糖基化寡糖的合成方法。
技术介绍
随着生物科技和食品工业的快速发展，功能性寡糖的研究与开发已成为国际生物技术的前沿方向，主要集中于天然植物和微生物来源的多糖，经酸碱等降解后制备的低分子量的寡糖；并且，寡糖产业已成为应用于食品、医药、农业和化工等行业的新兴产业，且市场份额巨大。岩藻糖基化寡糖即是一类功能性寡糖类物质，其在血液运输、选择性调解白细胞内皮粘合以及个体发育过程中都起着重要的作用。据研究，当人体内的岩藻糖基化寡糖含量减少时，则会引发一些严重的疾病，像白细胞粘合缺陷病，更严重者则会直接导致癌症和动脉粥样硬化的发生。人乳寡糖(HMOs)是一种于人乳中游离的寡糖，其在人乳中的含量仅次于脂肪和乳糖，是人乳中的第三大固体物质，更是人乳中重要的活性因子。HMOs的结构复杂且种类繁多，而且70％的HMOs都属于岩藻糖基化寡糖。人乳寡糖具有调节肠道菌群、增强免疫力、抗病毒感染、减少炎症以及促进婴儿大脑发育等生理作用，作为一类特殊结构的功能性寡糖类物质，参与婴儿的非免疫防御体系的增强，在婴儿营养保健方面必将发挥其巨大的作用。最初生产岩藻糖基化寡糖的工艺主要是利用化学合成法，但化学合成法一方面存在合成路线复杂、且反应条件控制严格的缺陷，而且合成时还需要注意催化剂的选择，设计合适保护基团以及确定供体的离去基团；而且因为合成寡糖的糖苷供体价格昂贵而导致最终的合成成本昂贵。相比于化学合成方法，利用生物技术生产岩藻糖基化寡糖具有诸多优点，并且随着岩藻糖基转移酶基因在细菌中被发现，全细胞生物合成法和酶法合成工艺成为生物
生产岩藻糖基化寡糖的两大主要路线。全细胞生物合成法是利用基因工程和代谢工程技术将相应的基因插入到细胞的基因组内，并利用细胞自身的代谢生成岩藻糖基化寡糖。该方法需要细胞表达过量的岩藻糖基转移酶，并提供大量的供体GDP-岩藻糖(鸟苷酸二磷酸-岩藻糖)以保证受体及产物在细胞内不被分解掉。酶法合成工艺是将所有参与催化合成岩藻糖基化寡糖的酶分离纯化出来并在体外进行催化反应的过程。该方法可通过对参与酶催化的岩藻糖基转移酶的改造，以提高酶的活性，进一步提高岩藻糖基化寡糖的产量。α-1,2-岩藻糖基转移酶是将岩藻糖基转移到相应寡糖上以形成α-1,2-连接的酶。α-1,2-岩藻糖基转移酶属于Glycosyltransferasefamily11，目前已在哺乳动物、病毒、植物、细菌中均发现了α-1,2-岩藻糖基转移酶的基因，并对其酶学性质也有不同程度的研究进展。α-1,2-岩藻糖基转移酶表现出广泛的底物特异性，为合成α-1,2-岩藻糖基化寡糖提供了巨大的优势，然而现有技术利用生物技术生产岩藻糖基化寡糖时，岩藻糖基化寡糖的产量还需要进一步提高。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题在于提供一种酶法合成α-1,2-岩藻糖基化寡糖的方法，以解决现有技术中化学合成法工艺路线复杂及成本较高以及生物法产量需要提高的问题。为了实现上述目的，第一方面，本专利技术提供一种重组大肠杆菌系统，该重组大肠杆菌系统具有α-1,2-岩藻糖基转移酶基因和GDP-岩藻糖焦磷酸化酶基因。第二方面，本专利技术提供如上所述的重组大肠杆菌系统的构建方法，该方法包括：(1)克隆α-1,2-岩藻糖基转移酶基因，并构建所述α-1,2-岩藻糖基转移酶基因的表达载体；(2)克隆GDP-岩藻糖焦磷酸化酶基因，并构建所述GDP-岩藻糖焦磷酸化酶基因的表达载体；(3)将步骤(1)和步骤(2)获得的表达载体转化入大肠杆菌细胞中，得到所述重组大肠杆菌系统。第三方面，本专利技术提供如上所述的重组大肠杆菌系统在合成α-1,2-岩藻糖基化寡糖中的应用。第四方面，本专利技术提供一种α-1,2-岩藻糖基化寡糖的合成方法，该方法包括：(1)在大肠杆菌能够繁殖的条件下，使如上所述的重组大肠杆菌系统繁殖并表达所述α-1,2-岩藻糖基转移酶基因和所述GDP-岩藻糖焦磷酸化酶基因，获得α-1,2-岩藻糖基转移酶和GDP-岩藻糖焦磷酸化酶；(2)将步骤(1)获得的α-1,2-岩藻糖基转移酶和GDP-岩藻糖焦磷酸化酶与转化底物接触，合成所述α-1,2-岩藻糖基化寡糖。本专利技术通过将α-1,2-岩藻糖基转移酶基因和GDP-岩藻糖焦磷酸化酶基因转化到大肠杆菌中，构建基因工程菌，以表达α-1,2-岩藻糖基转移酶和GDP-岩藻糖焦磷酸化酶，并将表达的α-1,2-岩藻糖基转移酶和GDP-岩藻糖焦磷酸化酶用于酶法合成α-1,2-岩藻糖基化寡糖的，相比于他来源的(例如，Pirkko等人利用重组大肠杆菌合成GDP-甘露糖，并进一步利用酵母菌表达系统成功合成GDP-岩藻糖[MattilaP,JarkkoHortlingS,etal.FunctionalexpressionofEscherichiacolienzymessynthesizingGDP-L-fucosefrominherentGDP-D-mannoseinSaccharomycescerevisiae[J].Glycobiology,2000,10(10):1041-7.])的α-1,2-岩藻糖基转移酶催化产率提高了145.23％。附图说明图1为α-1,2-岩藻糖基转移酶(HpFutr)(a)和GDP-岩藻糖焦磷酸化酶(FKP)(b)的SDS-PAGE电泳图。图2为本专利技术提供的α-1,2-岩藻糖基化寡糖的合成过程示意图。具体实施方式在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。根据本专利技术的第一方面，提供一种重组大肠杆菌系统，该重组大肠杆菌系统转化有α-1,2-岩藻糖基转移酶基因和GDP-岩藻糖焦磷酸化酶基因。根据本专利技术，所述α-1,2-岩藻糖基转移酶基因可以为现有的各种编码α-1,2-岩藻糖基转移酶的核苷酸序列，根据本专利技术一种优选的实施方式，所述α-1,2-岩藻糖基转移酶基因来源于幽门螺杆菌，更优选的，所述α-1,2-岩藻糖基转移酶基因具有如SEQIDNO:1所示的核苷酸序列。根据本专利技术，所述GDP-岩藻糖焦磷酸化酶基因可以为现有的各种编码GDP-岩藻糖焦磷酸化酶的核苷酸序列，根据本专利技术一种优选的实施方式，所述GDP-岩藻糖焦磷酸化酶基因来源于脆弱拟杆菌，更优选的，所述GDP-岩藻糖焦磷酸化酶基因具有如SEQIDNO:2所示的核苷酸序列。根据本专利技术，所述α-1,2-岩藻糖基转移酶基因和GDP-岩藻糖焦磷酸化酶基因可以通过分别插入到载体中从而构建表达α-1,2-岩藻糖本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种重组大肠杆菌系统，其特征在于，该重组大肠杆菌系统具有α-1,2-岩藻糖基转移酶基因和GDP-岩藻糖焦磷酸化酶基因。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20191115 CN 2019111195059一种重组大肠杆菌系统，其特征在于，该重组大肠杆菌系统具有α-1,2-岩藻糖基转移酶基因和GDP-岩藻糖焦磷酸化酶基因。


根据权利要求1所述的重组大肠杆菌系统，其中，所述α-1,2-岩藻糖基转移酶基因来源于源自幽门螺杆菌，和/或所述GDP-岩藻糖焦磷酸化酶基因来源于脆弱拟杆菌；
优选的，所述α-1,2-岩藻糖基转移酶基因具有如SEQIDNO:1所示的核苷酸序列，和/或所述GDP-岩藻糖焦磷酸化酶基因具有如SEQIDNO:2所示的核苷酸序列。


根据权利要求1或2所述的重组大肠杆菌系统，其中，用于构建所述大肠杆菌系统的大肠杆菌细胞为大肠杆菌C43细胞；
优选的，所述α-1,2-岩藻糖基转移酶基因和GDP-岩藻糖焦磷酸化酶基因包括在同一大肠杆菌细胞中；或者
所述α-1,2-岩藻糖基转移酶基因和GDP-岩藻糖焦磷酸化酶基因包括在不同大肠杆菌细胞中。


权利要求1-3中任意一项所述的重组大肠杆菌系统的构建方法，其特征在于，该方法包括：
(1)克隆α-1,2-岩藻糖基转移酶基因，并构建所述α-1,2-岩藻糖基转移酶基因的表达载体；
(2)克隆GDP-岩藻糖焦磷酸化酶基因，并构建所述GDP-岩藻糖焦磷酸化酶基因的表达载体；
(3)将步骤(1)和步骤(2)获得的表达载体转化入大肠杆菌细胞中，得到所述重组大肠杆菌系统。


根据权利要求4所述的方法，其中，步骤(1)中，使用pColdI质粒构建所述α-1,2-岩藻糖基转移酶基因的表达载体；
优选的，所述α-1,2-岩藻糖基转移酶基因的表达载体的构建方法包括：
(1)以克隆的α-1,2-岩藻糖基转移酶基因为模板，以SEQIDNO:3所示的正向引物和SEQIDNO:4所示的反向引物为引物进行PCR扩增；
(2)将所得PCR扩增产物用BamHI和HindIII进行双酶切处理，并与BamH...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄锦，薛晓舟，李玉，秦慧民，佟毅，李义，陈博，李凡，安泰，
申请(专利权)人：中粮营养健康研究院有限公司，吉林中粮生化有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11