膜蛋白CcmB的表达载体及其表达纯化方法技术

本发明专利技术公开了一种膜蛋白CcmB的表达载体及其表达纯化方法。所述的表达载体的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，包含：噬菌体T7启动子；大肠杆菌核糖体结合位点，其中包含了NcoI序列CCATGG、SEQ ID NO.1所示的大肠杆菌膜蛋白CcmB序列以及BamHI位点GGATCC；烟草蚀纹病毒半胱氨酸蛋白酶切割位点GAGAACCTGTACTTCCAATCC；NdeI酶切位点CATATG；超折叠维纳斯荧光蛋白编码序列；XhoI酶切位点CTCGAG；6个组氨酸位点以及终止密码子TAG。本发明专利技术利用分子刚性的荧光蛋白作为筛选标记以及表达进程指示剂，该荧光蛋白由于具有分子水平刚性结构可以迅速折叠，能够帮助氮端膜蛋白CcmB稳定其构象。本发明专利技术构建的表达载体能够实现膜蛋白CcmB的大量表达，可用于后续新型抗生素的高通量筛选。

【技术实现步骤摘要】
膜蛋白CcmB的表达载体及其表达纯化方法
本专利技术属于蛋白质生产
，涉及一种膜蛋白血红素分泌蛋白B亚基(CcmB)的表达载体及其表达纯化方法。
技术介绍
细胞膜是细胞内部与外部的边界，担负着信息传递、能量传输和物质交换的重要功能，是最重要的细胞器。药物作用的靶点经常位于细胞膜上。目前已知50％以上药物作用的靶标是膜蛋白。因此，对于膜蛋白的研究具有非常重要的意义。然而，膜蛋白由于其天然状态的含量稀少，具有多次跨膜结构，因而折叠容易出现错误，结构复杂，所以膜蛋白的大规模制备一直是难点和热点。在国内，基本没有生物公司可以做到12次以上的跨膜蛋白的表达，只有一两家公司可以做到四次跨膜蛋白的表达。大肠杆菌作为常用的表达宿主一直是蛋白表达的首选，然而，即使是大肠杆菌自身蛋白都很难在大肠杆菌中大量表达。目前，由于抗生素的滥用，导致在今后的50年内面临无法对抗耐药菌的窘境。因此通过大量表达膜蛋白作为抗生素的作用靶点，为后续非变性质谱的高通量筛选提供先导性技术支持。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种大量表达膜蛋白血红素分泌蛋白B亚基(CcmB)的表达载体及其表达纯化方法。本专利技术针对大肠杆菌膜蛋白CcmB，建立高效的融合表达系统，可以用于后续进一步的蛋白质非变性实时监控质谱研究。实现本专利技术目的的技术方案如下：本专利技术的膜蛋白CcmB的表达载体，以本实验室获得的用于莱茵衣藻蛋白质定位的超折叠维纳斯荧光蛋白(中国专利申请201910347575.3)作为起始蛋白质骨架，通过对序列表达所用的密码子组成进行进一步优化，获得分子刚性的荧光蛋白表达标签并且适用于大肠杆菌膜蛋白的大规模表达。本专利技术利用分子刚性的荧光蛋白作为筛选标记以及表达进程指示剂，并且该荧光蛋白由于具有分子水平刚性结构可以迅速折叠，并且帮助氮端膜蛋白CcmB稳定其构象。本专利技术的膜蛋白CcmB的表达载体为表达质粒pLy077-CcmB(SEQIDNO.2)，包含：噬菌体T7启动子；大肠杆菌核糖体结合位点，其中包含NcoI序列CCATGG、大肠杆菌膜蛋白CcmB序列(SEQIDNO.1)以及BamHI位点GGATCC；烟草蚀纹病毒半胱氨酸蛋白酶切割位点GAGAACCTGTACTTCCAATCC；NdeI酶切位点CATATG；超折叠维纳斯荧光蛋白编码序列；XhoI酶切位点CTCGAG；6个组氨酸位点以及终止密码子TAG。本专利技术还提供上述膜蛋白CcmB的表达载体的表达纯化方法，具体步骤如下：步骤1，大肠杆菌膜蛋白CcmB表达载体突变株的制备：将膜蛋白CcmB的表达载体即表达质粒pLy077-CcmB转化到宿主大肠杆菌中，并涂布于含抗生素以及0.1mMIPTG琼脂平板，挑选黄绿色的阳性单克隆菌进行扩大培养和诱导表达；步骤2，将挑选的突变菌株转化株接种至培养基中进行扩大培养，并用1mMIPTG大规模诱导表达膜蛋白CcmB。优选地，步骤1中，所述的大肠杆菌为大肠杆菌BL21(DE3)或大肠杆菌C43(DE3)。优选地，步骤2中，所述的培养基为LB培养基或TB培养基。本专利技术通过全合成表达载体，将目标基因和密码子优化过的具有分子刚性的超折叠维纳斯荧光蛋白引入表达载体中，并通过在核酸编码一级序列进行优化，大大提高了目标基因的转录和翻译效率。此外，通过控制羧基端刚性荧光蛋白的折叠速度，帮助目标膜蛋白正确折叠并插入膜中。刚性荧光蛋白不仅可以用于监测蛋白质的实时表达进程，还可以用于保护蛋白的羧基端，从而使得目标蛋白得到富集。本专利技术通过对大肠杆菌膜蛋白的大量表达，后期纯化以便实现对于新型抗生素的高通量筛选，具有重要的商业化前景。附图说明图1为CcmB蛋白编码序列的PCR琼脂糖凝胶电泳结果图。图2为pLy077-CcmB质粒的结构示意图。图3为pLy077-CcmB菌落PCR验证结果图。图4为质粒pLy077-CcmB的NcoIⅠ和BamHIⅠ单酶切双酶切琼脂糖凝胶电泳结果图。图5为重组质粒测序验证结果图。图6为pLy077-CcmB在不同表达菌株和培养基的生长曲线图。图7为转化琼脂平板上的菌落荧光图。图8为以大肠杆菌BL21为表达菌株，在LB培养基中诱导后的荧光成像以及诱导前后全菌蛋白对比图。图9为以大肠杆菌C43为表达菌株，在TB培养基中诱导后的荧光成像以及诱导前后全菌蛋白对比图。具体实施方式下面结合具体实施例和附图对本专利技术作进一步的说明，但并不局限于此。实施本专利技术的过程、条件、试剂、实验方法等，除以下专门提及的内容之外，均为本领域的普遍知识和公知常识，本专利技术没有特别限制内容。实施例中所用材料如下：1.细胞来源大肠杆菌DH5α、BL21(DE3)，C41(DE3)，C43(DE3)菌株购自武汉灵淼生物公司。2.质粒来源pLy077质粒和CcmB编码序列由上海生工生物有限公司合成，pLy077质粒包含：噬菌体T7启动子；大肠杆菌核糖体结合位点，其中包含了NcoI序列CCATGG以及BamHI位点GGATCC；烟草蚀纹病毒半胱氨酸蛋白酶切割位点GAGAACCTGTACTTCCAATCC；NdeI酶切位点CATATG；超折叠维纳斯荧光蛋白编码序列；XhoI酶切位点CTCGAG；6个组氨酸位点以及终止密码子TAG。pLy077质粒和CcmB编码序列见序列表。3.引物来源合成引物均来自北京擎科生物技术有限公司。4.主要试剂胰蛋白胨、酵母提取物、NaCl、Tris-baes均购自Sigma公司；限制性核酸内切酶、phusion酶购自ThermoFisher公司；rTaq酶、T4连接酶购自Takara公司。质粒小提试剂盒、凝胶回收试剂盒购自Axygen公司。NTP、DEPC水、RNaseinhibitor购自上海生物生工有限公司。实施例1CcmB的基因克隆1.CcmB的克隆a)根据对比CcmB序列所用密码子与Kazusa在线数据库(http://www.kazusa.or.jp/codon/)下的Escherichiacoli密码子使用频率，设计全新CcmB编码序列(SEQIDNO.1)，并合成。之后通过PCR方法扩增。PCR反应体系配置如表1所示。表1PCR反应体系配制表试剂名称储备液浓度加入PCR反应体系的体积(μL)5×HFBuffer5×10dNTPMix10mmol/L2Forwardprimer10μmol/L2.5Reverseprimer10μmol/L2.5Phusion酶5U/μL0.5DNA模板50ng/μL2MilliQH2O加Mill本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.膜蛋白CcmB的表达载体，其特征在于，为表达质粒pLy077-CcmB，核苷酸序列如SEQID NO.2所示，包含：噬菌体T7启动子；大肠杆菌核糖体结合位点，其中包含NcoI序列CCATGG、SEQ ID NO.1所示的大肠杆菌膜蛋白CcmB序列以及BamHI位点GGATCC；烟草蚀纹病毒半胱氨酸蛋白酶切割位点GAGAACCTGTACTTCCAATCC；NdeI酶切位点CATATG；超折叠维纳斯荧光蛋白编码序列；XhoI酶切位点CTCGAG；6个组氨酸位点以及终止密码子TAG。/n

【技术特征摘要】
1.膜蛋白CcmB的表达载体，其特征在于，为表达质粒pLy077-CcmB，核苷酸序列如SEQIDNO.2所示，包含：噬菌体T7启动子；大肠杆菌核糖体结合位点，其中包含NcoI序列CCATGG、SEQIDNO.1所示的大肠杆菌膜蛋白CcmB序列以及BamHI位点GGATCC；烟草蚀纹病毒半胱氨酸蛋白酶切割位点GAGAACCTGTACTTCCAATCC；NdeI酶切位点CATATG；超折叠维纳斯荧光蛋白编码序列；XhoI酶切位点CTCGAG；6个组氨酸位点以及终止密码子TAG。


2.根据权利要求1所述的膜蛋白CcmB的表达载体的表达纯化方法，其特征在于，具体步骤如下：
步骤1，...

【专利技术属性】
技术研发人员：周敏，张苑桢，华铮翼，卢颖洪，
申请(专利权)人：南京理工大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32