一种人神经丝轻链的原核表达载体构建及蛋白的纯化方法技术

本发明专利技术公开了一种人神经丝轻链的原核表达载体构建及蛋白的纯化方法，通过基因合成技术将重组NEFL密码子优化后亚克隆至pET‑22b(+)，pET‑32a(+)和pSmart‑I中，构建重NEFL质粒；利用构建好的重NEFL质粒制备表达载体转化表达菌感受态细胞；利用菌落SDS‑PAGE方法，鉴定目的蛋白是否在大肠杆菌中大量表达；再根据SDS‑PAGE结果，判断目的蛋白是以包涵体还是以可溶性蛋白的形式产生，确定最适的上清表达诱导条件；最后纯化目的蛋白并将纯化后的目的蛋白进行透析、浓缩；本发明专利技术对基因进行密码子优化，运用不同的表达载体，进行了最优克隆的筛选及最优表达时间的优化，提高了该蛋白的上清表达量。

【技术实现步骤摘要】
一种人神经丝轻链的原核表达载体构建及蛋白的纯化方法
本专利技术属于生物
，具体的，涉及一种人神经丝轻链的原核表达载体构建及蛋白的纯化方法。
技术介绍
神经中间丝或称神经纤维丝包括3个亚基∶神经丝轻链(neurofilamentlightpolypeptide，NEFL)、神经丝中链(NEFM)和神经丝重链(NEFH)，相对分子质量分别为68，000、160，000和212，000。NEFL是唯一可以自我组装的亚单位，NEFL在体外可自我组装成同型多聚体的10nm的纤维，当NEFL亚单位缺少时，神经丝中链多肽和神经丝重链多肽亚单位不能组装成功能性神经丝蛋白，因而NEFL被认为是最重要的神经纤维丝。NEFL是组成神经细胞骨架的关键成分，并与对神经细胞塑形至关重要的多个蛋白靶点有相互联系，在维持神经细胞形态及使有髓鞘的轴突再生方面起关键性作用。近年来发现，NEFL与神经系统相关疾病的关系密切，是阿尔茨海默病、脑震荡、帕金森氏综合征等脑部病变的血液生物标志物，也发现NEFL可能与神经系统以外肿瘤的发生、发展密切相关，如乳腺癌、肺癌、头颈部肿瘤等。因此，采用具有高灵敏度和高特异性的检测NEFL方法在相关人群中进行筛查，对相关疾病的诊断具有重大意义。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种人神经丝轻链的原核表达载体构建及蛋白的纯化方法。本专利技术需要解决的技术问题为：近年来发现，NEFL与神经系统相关疾病的关系密切，是阿尔茨海默病、脑震荡、帕金森氏综合征等脑部病变的血液生物标志物，也发现NEFL可能与神经系统以外肿瘤的发生、发展密切相关，如乳腺癌、肺癌、头颈部肿瘤等。因此，采用具有高灵敏度和高特异性的检测NEFL方法在相关人群中进行筛查，对相关疾病的诊断具有重大意义。本专利技术的目的可以通过以下技术方案实现：一种人神经丝轻链的原核表达载体构建及蛋白的纯化方法，具体包括如下步骤：1重组质粒构建：通过基因合成技术将重组NEFL密码子优化后亚克隆至pET-22b(+)，pET-32a(+)和pSmart-I中，构建重NEFL质粒；2转化表达茵：利用构建好的重NEFL质粒制备表达载体转化表达菌感受态细胞；3目的蛋白的诱导表达：首先制备空白对照组和诱导组菌体，利用菌落SDS-PAGE方法，鉴定目的蛋白是否在大肠杆菌BL21中大量表达；再根据SDS-PAGE结果，判断目的蛋白是以包涵体还是以可溶性蛋白的形式产生，确定最适的上清表达诱导条件；最后纯化目的蛋白；4蛋白的透析和浓缩：将纯化后的目的蛋白进行透析、浓缩，做好收集存储。进一步地，所述重NEFL质粒表达的重组蛋白序列为：MSSFSYEPYYSTSYKRRYVETPRVHISSVRSGYSTARSAYSSYSAPVSSSLSVRRSYSSSSGSLMPSLENLDLSQVAAISNDLKSIRTQEKAQLQDLNDRFASFIERVHELEQQNKVLEAELLVLRQKHSEPSRFRALYEQEIRDLRLAAEDATNEKQALQGEREGLEETLRNLQARYEEEVLSREDAEGRLMEARKGADEAALARAELEKRIDSLMDEISFLKKVHEEEIAELQAQIQYAQISVEMDVTKPDLSAALKDIRAQYEKLAAKNMQNAEEWFKSRFTVLTESAAKNTDAVRAAKDEVSESRRLLKAKTLEIEACRGMNEALEKQLQELEDKQNADISAMQDTINKLENELRTTKSEMARYLKEYQDLLNVKMALDIEIAAYRKLLEGEETRLSFTSVGSITSGYSQSSQVFGRSAYGGLQTSSYLMSTRSFPSYYTSHVQEEQIEVEETIEAAKAEEAKDEPPSEGEAEEEEKDKEEAEEEEAAEEEEAAKEESEEAKEEEEGGEGEEGEETKEAEEEEKKVEGAGEEQAAKKKD。进一步地，所述转化表达茵的具体步骤如下：参考碧云天超级感受态制备试剂盒技术，制备出感受态细胞，然后将构建好的1μL重NEFL质粒分别加入至100μL的感受态细胞中，轻轻混合均匀，置于冰上30min，再于42℃水浴条件下，热激90s后立即转移至冰上放置5min，得第一混合物，向第一混合物中加入500μL的预热LB培养基，所述预热LB培养基为37℃水浴下放置2-3min后的LB培养基，然后于37℃下振荡培养1h，取出200μL培养的菌体，用涂布棒将其均匀涂在含有相应抗性的LB琼脂平板中，于温度为37℃下，倒置培养过夜。进一步地，所述鉴定目的蛋白是否在大肠杆菌BL21中大量表达的具体步骤如下：步骤S1、挑取单克隆大肠杆菌BL21菌落于4ml含相应抗生素的LB培养基，于温度为37℃，转速200r/min条件下，摇床培养，控制菌液OD600在0.6-1.0之间，得到培养物A，使大肠杆菌处于最适合表达外源蛋白的生长状态，然后从培养物A中取50μL菌液加入到新的4mL含相应抗生素的LB培养基中作为不加IPTG的空白对照组，其余菌液加入4μL储存浓度为1mol/L的IPTG，使IPTG终浓度达到1mmol/L，以200r/min的转速，于37℃温度下，摇床培养3-4h，得到诱导组，然后以转速12000r/min将空白对照组、诱导组离心1min，收集空白对照组和诱导组各1mL菌体，倾倒上清，得到空白对照组菌体和诱导组菌体；步骤S2、向步骤S1得到的空白对照组菌体和诱导组菌体中加入100μLPBSBuffer，然后用漩涡器剧烈震荡，确保将管底沉淀震散，再加入100μL2×SDSPAGEloadingbuffer，混合均匀，得到空白对照组菌体样品和诱导组菌体样品，将空白对照组菌体样品和诱导组菌体样品置于水浴锅中煮沸5min，然后冷却至室温，以转速12000r/min离心1min，分别取两组样品的上清点样进行SDS-PAGE电泳，分离胶的浓度为12％，上样量为20μL，marker上样量为10μL，当电压达到85V时，保证电流在20-30mA，当样品混入浓缩胶中时可调高电压至135V，当溴酚蓝电泳至胶槽底部时，停止电泳，剥胶，将浓缩胶部分切除后，加入考马斯亮蓝染色液，40r/min转速下染色3h，然后用移液管回收考马斯亮蓝染色液，再用蒸馏水将浮色冲洗干净后，加入考马斯亮蓝脱色液，40r/min转速下，脱色至胶背景透明，期间每2h更换一次脱色夜，根据菌落SDS-PAGE的结果，可以看到目的蛋白是否大量表达。进一步地，所述判断目的蛋白是以包涵体还是以可溶性蛋白的形式产生的具体步骤为：从冻存的菌液中取50μL接种于4mL的LB培养基中，向LB培养基中加入4μL相应的抗生素，所述抗生素的浓度为100mg/mL，过夜活化菌株；然后从活化菌株中取40μL菌种按照1:100的比例接种于4mL的LB培养基中，再向LB培养基中加入40μL浓度为100mg/mL的抗生素，扩大培养3h，等量分成8个样品，先取4个样品向其中3个加入IP本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种人神经丝轻链的原核表达载体构建及蛋白的纯化方法，其特征在于,具体包括如下步骤：/n1重组质粒构建：通过基因合成技术将重组NEFL密码子优化后亚克隆至pET-22b(+)，pET-32a(+)和pSmart-I中，构建重NEFL质粒；/n2转化表达茵：利用构建好的重NEFL质粒制备表达载体转化表达菌感受态细胞；/n3目的蛋白的诱导表达：首先制备空白对照组和诱导组菌体，利用菌落SDS-PAGE方法，鉴定目的蛋白是否在大肠杆菌BL21中大量表达；再根据SDS-PAGE结果，判断目的蛋白是以包涵体还是以可溶性蛋白的形式产生，确定最适的上清表达诱导条件；最后纯化目的蛋白；/n4蛋白的透析和浓缩：将纯化后的目的蛋白进行透析、浓缩，做好收集存储。/n

【技术特征摘要】
1.一种人神经丝轻链的原核表达载体构建及蛋白的纯化方法，其特征在于,具体包括如下步骤：
1重组质粒构建：通过基因合成技术将重组NEFL密码子优化后亚克隆至pET-22b(+)，pET-32a(+)和pSmart-I中，构建重NEFL质粒；
2转化表达茵：利用构建好的重NEFL质粒制备表达载体转化表达菌感受态细胞；
3目的蛋白的诱导表达：首先制备空白对照组和诱导组菌体，利用菌落SDS-PAGE方法，鉴定目的蛋白是否在大肠杆菌BL21中大量表达；再根据SDS-PAGE结果，判断目的蛋白是以包涵体还是以可溶性蛋白的形式产生，确定最适的上清表达诱导条件；最后纯化目的蛋白；
4蛋白的透析和浓缩：将纯化后的目的蛋白进行透析、浓缩，做好收集存储。


2.根据权利要求1所述的一种人神经丝轻链的原核表达载体构建及蛋白的纯化方法，其特征在于，所述重NEFL质粒表达的重组蛋白序列为：
MSSFSYEPYYSTSYKRRYVETPRVHISSVRSGYSTARSAYSSYSAPVSSSLSVRRSYSSSSGSLMPSLENLDLSQVAAISNDLKSIRTQEKAQLQDLNDRFASFIERVHELEQQNKVLEAELLVLRQKHSEPSRFRALYEQEIRDLRLAAEDATNEKQALQGEREGLEETLRNLQARYEEEVLSREDAEGRLMEARKGADEAALARAELEKRIDSLMDEISFLKKVHEEEIAELQAQIQYAQISVEMDVTKPDLSAALKDIRAQYEKLAAKNMQNAEEWFKSRFTVLTESAAKNTDAVRAAKDEVSESRRLLKAKTLEIEACRGMNEALEKQLQELEDKQNADISAMQDTINKLENELRTTKSEMARYLKEYQDLLNVKMALDIEIAAYRKLLEGEETRLSFTSVGSITSGYSQSSQVFGRSAYGGLQTSSYLMSTRSFPSYYTSHVQEEQIEVEETIEAAKAEEAKDEPPSEGEAEEEEKDKEEAEEEEAAEEEEAAKEESEEAKEEEEGGEGEEGEETKEAEEEEKKVEGAGEEQAAKKKD。


3.根据权利要求1所述的一种人神经丝轻链的原核表达载体构建及蛋白的纯化方法，其特征在于，所述转化表达茵的具体步骤如下：参考碧云天超级感受态制备试剂盒技术，制备出感受态细胞，然后将构建好的1μL重NEFL质粒分别加入至100μL的感受态细胞中，轻轻混合均匀，置于冰上30min，再于42℃水浴条件下，热激90s后立即转移至冰上放置5min，得第一混合物，向第一混合物中加入500μL的预热LB培养基，所述预热LB培养基为37℃水浴下放置2-3min后的LB培养基，然后于37℃下振荡培养1h，取出200μL培养的菌体，用涂布棒将其均匀涂在含有相应抗性的LB琼脂平板中，于温度为37℃下，倒置培养过夜。


4.根据权利要求1所述的一种人神经丝轻链的原核表达载体构建及蛋白的纯化方法，其特征在于，所述鉴定目的蛋白是否在大肠杆菌BL21中大量表达的具体步骤如下：
步骤S1、挑取单克隆大肠杆菌BL21菌落于4ml含相应抗生素的LB培养基，于温度为37℃，转速200r/min条件下，摇床培养，控制菌液OD600在0.6-1.0之间，得到培养物A，使大肠杆菌处于最适合表达外源蛋白的生长状态，然后从培养物A中取50μL菌液加入到新的4mL含相应抗生素的LB培养基中作为不加IPTG的空白对照组，其余菌液加入4μL储存浓度为1mol/L的IPTG，使IPTG终浓度达到1mmol/L，以200r/min的转速，于37℃温度下，摇床培养3-4h，得到诱导组，然后以转速12000r/min将空白对照组、诱导组离心1min，收集空白对照组和诱导组各1mL菌体，倾倒上清，得到空白对照组菌体和诱导组菌体；
步骤S2、向步骤S1得到的空白对照组菌体和诱导组菌体中加入100μLPBSBuffer，然后用漩涡器剧烈震荡，确保将管底沉淀震散，再加入100μL2×SDSPAGEloadingbuffer，混合均匀，得到空白对照组菌体样品和诱导组菌体样品，将空白对照组菌体样品和诱导组菌体样品置于水浴锅中煮沸5min，然后冷却至室温，以转速12000r/min离心1min，分别取两组样品的上清点样进行SDS-PAGE电泳，分离胶的浓度为12％，上样量为20μL，marker上样量为10μL，当电压达到85V时，保证电流在20-30mA，当样品混入浓缩胶中时可调高电压至135V，当溴酚蓝电泳至胶槽底部时，停止电泳，剥胶，将浓缩胶部分切除后，加入考马斯亮蓝染色液，40r/min转速下染色3h，然后用移液管回收考马斯亮蓝染色液，再用蒸馏水将浮色冲洗干净后，加入考马斯亮蓝脱色液，40r/min转速下，脱色至胶背景透明，期间每2h更换一次脱色夜，根据菌落SDS-PAGE的结果，可以看到目的蛋白是否大量表达。


5.根据权利要求1所述的一种人神经丝轻链的原核表达载体构建及蛋白的纯化方法，其特征在于，所述判断目...

【专利技术属性】
技术研发人员：张志鹏，沈健，蒋克雪，
申请(专利权)人：安徽环球基因科技有限公司，
类型：发明
国别省市：安徽;34