益生菌嵌合传感器及其构建方法和应用技术

本发明专利技术涉及一种益生菌嵌合传感器及其构建方法和在检测钙卫蛋白中的应用。首先，针对需检测的目标蛋白质等特定生物大分子，设计可特异性结合目标蛋白的纳米抗体。随后，利用纳米抗体的编码序列与双组分系统组氨酸激酶受体的结合结构域进行交换融合，构建新的嵌合型组氨酸激酶受体，进一步与应答调节因子组成杂合双组分系统，从而创建依赖指定目标蛋白激发的嵌合双组分系统。该方法利用肠道益生菌为载体，对天然的双组分系统进行改造，创建自然界所不存在的益生菌大分子传感器，具有在肠道进行原位无创检测溃疡性结肠炎的优势，同时具有突出的灵敏度、稳定性及安全性。

【技术实现步骤摘要】
益生菌嵌合传感器及其构建方法和应用
本专利技术涉及生物技术应用领域，具体涉及一种基于双组分系统(组氨酸激酶受体，应答调节因子)两个组成部分进行嵌合重组改造，人工构建针对特定生物大分子的响应传感系统。
技术介绍
双组分系统，包含组氨酸激酶(Histidinekinases，HK)及应答调节因子(Responseregulator，RR)两个典型的功能蛋白。组氨酸激酶，主要由位于N-端可变的配体结合结构域(Ligandbindingdomain，LBD)，跨膜结构域(TM)，以及位于C-端相对保守的二聚化/磷酸转移结构域(DHp)，ATP结合/催化结构域(CA)等功能域组成。应答调节因子，则包括两个主要的功能区域，分别是位于N-端的信号接收结构域(Receiverdomain，REC)，以及位于C-端的DNA-结合结构域(DNAbindingdomain，DBD)。当输入信号出现时，通常位于膜外的HK-LBD，从静默构象迅速切换至激活构象，这种构象重排将传递信息至膜内的C端信号转导区，由HK-CA结构域催化从ATP获得γ-磷酰基团，再递呈至位于HK-DHp区高度保守的组氨酸残基，完成激酶传感器的磷酸化激活。随后，激活的组氨酸激酶通过HK-DHp区介导，结合胞内的RR，传递磷酰基至N-端的RR-REC，从而使保守的天冬氨酸残基发生磷酸化，再激活位于C端的RR-DBD，完成信号从HK传递激活至RR的过程。激活状态的RR，可实现对下游一个或多个输出启动子的转录调控。天然存在的双组分系统，响应对象主要为一系列小分子物质，如钾离子，氮离子等(RiglarDT,GiessenTW,BaymM,etal.Engineeredbacteriacanfunctioninthemammaliangutlong-termaslivediagnosticsofinflammation.NatureBiotechnology2017,35:653-658.)。目前，未见有针对蛋白质等大分子的双组分系统传感通路，然而，在临床疾病模型中，其特征性标志物常为蛋白质等大分子，此时，若要实现对此类特征性标志物的检测，通常需预先获得针对性的特异性抗体，进一步组装为经典的酶联检测试剂盒，方能实现对标志物分子的定性或定量检测。本方法以溃疡性结肠炎为疾病模型，针对溃疡性结肠炎临床检验使用的钙卫蛋白(Calprotectin)炎症因子标志物，利用益生菌株为载体构建了一种全细胞传感器。通过将可表达针对钙卫蛋白的特异性纳米抗体编码序列，活性替换融合天然双组分系统组氨酸激酶受体的配体结合结构域，从而获得由益生菌携带的，针对钙卫蛋白大分子标志物的嵌合型双组分传感系统，有望在肠道共生定殖状态下，以无创、非侵入方式实现对生物大分子标志物的检测响应。
技术实现思路
为探索创建自然界所不存在的针对蛋白质等生物大分子的肠道益生菌传感器，本专利技术的首要目的是提供一种通用的功能域融合重组技术，采用针对目标大分子的特异性纳米抗体编码序列，对肠道益生菌内源的双组分系统进行活性融合，构建可响应溃疡性结肠炎钙卫蛋白标志物分子的工程益生菌。具体而言，本专利技术包括如下技术方案：根据本专利技术的第一个方面，提供一种益生菌嵌合传感器构建方法，包括如下步骤：S1.益生菌载体菌种挑选：选择合适的益生菌株；S2.准备用于构建传感器的质粒骨架pRR-thsR和pHK-thsS；S3.依据步骤S2中的质粒骨架，进行双组分系统组氨酸激酶受体的改造：利用可特异性结合目标蛋白的纳米抗体NbCP17的编码序列与计算机模拟分析得到的组氨酸激酶受体结合结构域及两侧位置进行交换融合，构建嵌合型组氨酸激酶受体文库；S4.利用步骤S3获得的组氨酸激酶嵌合受体文库，构建可检测钙卫蛋白目标分子的组氨酸激酶嵌合受体的益生菌株：与应答调节因子组成杂合双组分系统，从而创建依赖指定目标蛋白激发的嵌合双组分系统，形成益生菌嵌合传感器；其中，所述嵌合型组氨酸激酶受体为pHK-Ptac-thsS-NbCP，所述应答调节因子为pRR-PLtetO-1-thsR-sfGFP。所述pRR-thsR和pHK-thsS可通过文献LandryBP,PalankiR,DyulgyarovN,etal.Phosphataseactivitytunestwo-componentsystemsensordetectionthreshold.NatureCommuncations2018,9:1433，按指示途径获得质粒骨架。进一步的，所述步骤S1中的益生菌株选自大肠杆菌Nissle1917或乳杆菌或双歧杆菌。进一步的，所述步骤S3中可特异性结合目标蛋白的纳米抗体NbCP17为免疫骆驼获得的针对钙卫蛋白分子的纳米抗体，其获取方式为：1)使用钙卫蛋白为抗原，与完全弗氏佐剂混合(v/v＝1:1)，充分乳化，皮下注射免疫双峰驼；从第2次免疫开始，使用不完全弗氏佐剂1:1混合乳化，间隔免疫5次；2)第5次免疫结束后第7天，采集骆驼颈部静脉血50mL，分离淋巴细胞，提取总RNA，反转录成cDNA；3)利用正向引物C-01：gtcctggctgctcttctacaagg(SEQIDNO.1)和反向引物C-02：ggtacgtgctgttgaactgttcc(SEQIDNO.2)，扩增获得650-750bp的片段，纯化后作为二轮扩增的模板；根据骆驼VHH片段上下游保守序列设计引物，钓取骆驼源VHHs编码序列，酶切连接噬菌粒载体Phen2，电转大肠杆菌TG1感受态，复性，涂板，37℃倒置培养，待菌体长成，洗下菌体；4)利用碳酸盐缓冲液稀释钙卫蛋白抗原，加入96孔酶联板，4℃过夜孵育制备抗原包被板；以辅助噬菌体M13K07感染TG1展示文库，经4轮筛选，获得亲和力相对最高的子文库，涂布双抗性平板，挑取单克隆，培养12-18小时表达抗体；离心取上清，加入抗原预制板，进行间接ELISA评估，选择效价最高的单克隆，测序获得纳米抗体的编码序列。进一步的，所述步骤S3中构建组氨酸激酶嵌合受体文库的方法如下：通过三维结构模拟比对，分析获得配体结合结构域对应的编码序列范围，随后采用无缝克隆的方式构建组氨酸激酶嵌合受体文库，并分别命名为pHK-Ptac-thsS-NbCP01、pHK-Ptac-thsS-NbCP02、pHK-Ptac-thsS-NbCP03、pHK-Ptac-thsS-NbCP04、pHK-Ptac-thsS-NbCP05、pHK-Ptac-thsS-NbCP06、pHK-Ptac-thsS-NbCP07、pHK-Ptac-thsS-NbCP08、pHK-Ptac-thsS-NbCP09、pHK-Ptac-thsS-NbCP10、pHK-Ptac-thsS-NbCP11、pHK-Ptac-thsS-NbCP12、pHK-Ptac-thsS-NbCP13、pHK-Ptac-thsS-NbCP14、pHK-Ptac-thsS-NbCP15、pHK-Ptac-thsS-NbCP16、pHK本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种益生菌嵌合传感器的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：/nS1.益生菌载体菌种挑选：选择合适的益生菌株；/nS2.准备用于构建传感器的质粒骨架pRR-thsR和pHK-thsS；/nS3.利用步骤S2中的质粒骨架，进行双组分系统组氨酸激酶受体的改造：利用可特异性结合目标蛋白的纳米抗体Nb

【技术特征摘要】
1.一种益生菌嵌合传感器的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1.益生菌载体菌种挑选：选择合适的益生菌株；
S2.准备用于构建传感器的质粒骨架pRR-thsR和pHK-thsS；
S3.利用步骤S2中的质粒骨架，进行双组分系统组氨酸激酶受体的改造：利用可特异性结合目标蛋白的纳米抗体NbCP17的编码序列与计算机模拟分析得到的组氨酸激酶受体结合结构域及两侧位置进行交换融合，构建嵌合型组氨酸激酶受体文库；
S4.利用步骤S3获得的嵌合型组氨酸激酶受体文库，构建可检测钙卫蛋白目标分子的组氨酸激酶嵌合受体的益生菌株：与应答调节因子组成杂合双组分系统，从而创建依赖指定目标蛋白激发的嵌合双组分系统，形成益生菌嵌合传感器；
其中，所述嵌合型组氨酸激酶受体为pHK-Ptac-thsS-NbCP，所述应答调节因子为pRR-PLtetO-1-thsR-sfGFP。


2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤S1中的益生菌株选自大肠杆菌Nissle1917、乳杆菌或双歧杆菌。


3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤S3中可特异性结合目标蛋白的纳米抗体NbCP17为免疫骆驼获得的针对钙卫蛋白分子的纳米抗体，其制备方法如下：
1)使用钙卫蛋白为抗原，与完全弗氏佐剂混合(v/v＝1:1)，充分乳化，皮下注射免疫双峰驼；从第2次免疫开始，使用不完全弗氏佐剂1:1混合乳化，间隔免疫5次；
2)第5次免疫结束后第7天，采集骆驼颈部静脉血50mL，分离淋巴细胞，提取总RNA，反转录成cDNA；
3)利用正向引物C-01：gtcctggctgctcttctacaagg(SEQIDNO.1)和反向引物C-02：ggtacgtgctgttgaactgttcc(SEQIDNO.2)，扩增获得650-750bp的片段，纯化后作为二轮扩增的模板；根据骆驼VHH片段上下游保守序列设计引物，钓取骆驼源VHHs编码序列，酶切连接噬菌粒载体Phen2，电转大肠杆菌TG1感受态，复性，涂板，37℃倒置培养，待菌体长成，洗下菌体；
4)利用碳酸盐缓冲液稀释钙卫蛋白抗原，加入96孔酶联板，4℃过夜孵育制备抗原包被板；以辅助噬菌体M13K07感染TG1展示文库，经4轮筛选，获得亲和力相对最高的子文库，涂布双抗性平板，挑取单克隆，培养12-18小时表达抗体；离心取上清，加入抗原预制板，...

【专利技术属性】
技术研发人员：熊亮斌，陈坚，张图，
申请(专利权)人：上海健康医学院，华卫安评医学研究上海有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31