一种制备异源四聚体α制造技术

本发明专利技术涉及基因工程和酶工程技术领域，提供了一种制备异源四聚体α

【技术实现步骤摘要】
一种制备异源四聚体α2β2型蓝藻PDHcE1方法
本专利技术涉及基因工程和酶工程
，更具体而言，涉及一种制备异源四聚体α2β2型蓝藻PDHcE1方法。
技术介绍
蓝藻是地球上最古老的物种之一，蓝藻丙酮酸脱氢酶的制备是研究其酶学性质、揭示丙酮酸脱氢酶定向分化等相关研究的基础，对研究以蓝藻丙酮酸脱氢酶为靶标的杀藻剂同样具有重要的科学意义。丙酮酸脱氢酶复合体(PyruvateDehydrogenasecomplex,PDHc)催化丙酮酸转化为乙酰辅酶A和CO2并为生物体提供能量。PDHc由三种不同的酶组份构成：丙酮酸脱羧酶E1(pyruvatedecarboxylase,EC1.2.4.1,PDHcE1)、二氢硫辛酰胺乙酰转移酶E2(EC2.3.1.12)和二氢硫辛酰胺脱氢酶E3(EC1.8.1.4)。PDHc还包括一些辅因子焦磷酸硫胺素、黄素腺嘌呤二核苷酸、硫辛酸和金属Mg2+等。PDHc在生命活动中起着重要作用，缺乏PDHc会导致生物体内碳水化合物的代谢障碍，造成能量供应不足，引起与丙酮酸代谢异常相关的疾病。PDHcE1催化丙酮酸的氧化脱羧，其催化效率决定了整个酶联反应的速率，是整个酶联反应中的限速步和唯一不可逆步。上世纪40年代，人们首先采用直接从生物组织中提取的方法制备丙酮酸脱氢酶。通过组织直接提取法，人们先后获得了大肠杆菌、嗜热芽胞杆菌、牛、玉米及豌豆等物种的丙酮酸脱氢酶。然而从生物组织中直接提取的丙酮酸脱氢酶存在产量少、纯度低等问题，其无法满足现代科学研究的需求。基因工程的发展使得人们可以在体外制备大量、高纯度的蛋白。人们通过基因工程的方法首先制备了结构简单的同源二聚体α2型丙酮酸脱氢酶，如大肠杆菌丙酮酸脱氢酶，而结构复杂的异源四聚体α2β2型PDHcE1的异源表达一直是难点，此类蛋白由α亚基和β亚基在生物体内通过折叠组装而成。研究人员首先尝试将嗜热脂肪芽孢杆菌PDHcE1的α亚基和β亚基分别表达，再将所获得的α亚基和β亚基混合在一起，期望使其在体外自组装为异源四聚体α2β2型嗜热脂肪芽孢杆菌PDHcE1，但由于缺少对α亚基和β亚基进行翻译后的必要修饰，α亚基和β亚基存在折叠和组装错误的问题，所获得的α2β2型嗜热脂肪芽孢杆菌PDHcE1几乎没有活性。这表明分别制备α亚基和β亚基，再进行体外组装的方法不可行。
技术实现思路
本专利技术提供一种制备异源四聚体α2β2型蓝藻PDHcE1的方法，以解决现有制备方法产量低或者无法获得高活性异源四聚体α2β2型蓝藻PDHcE1的问题。为解决上述技术问题，本专利技术提供了以下技术方案：本专利技术提供了一种制备异源四聚体α2β2型蓝藻PDHcE1方法，所述方法包括：分别制备蓝藻丙酮酸脱氢酶PDHcE1的α亚基和β亚基所对应的DNA片段，所述α亚基对应的DNA片段如SEQIDNo：1所示，所述β亚基对应的DNA片段如SEQIDNo：2所示；将所述α亚基对应的DNA片段和所述β亚基对应的DNA片段分别克隆到pETDuet-1载体的多克隆位点1区域和多克隆位点2区域，得到重组质粒pETDuet-1-α-β；将所述重组质粒pETDuet-1-α-β和伴侣蛋白表达质粒pGro7共转化到同一宿主细胞中，得到pETDuet-1-α-β-pGro7宿主细胞；宿主细胞培养，蛋白诱导表达，菌体收集；宿主细胞经超声波破碎后进行蛋白分离纯化，得到异源四聚体α2β2型蓝藻PDHcE1。优选的，所述将所述α亚基对应的DNA片段和所述β亚基对应的DNA片段分别克隆到pETDuet-1载体的多克隆位点1区域和多克隆位点2区域，得到重组质粒pETDuet-1-α-β，包括：先将所述α亚基对应的DNA片段克隆到所述pETDuet-1载体的多克隆位点1区域以构建重组质粒pETDuet-1-α，然后将所述β亚基对应的DNA片段克隆到所述重组质粒pETDuet-1-α载体的多克隆位点2区域以得到所述重组质粒pETDuet-1-α-β；或者，先将所述α亚基对应的DNA片段克隆到所述pETDuet-1载体的多克隆位点2区域以构建重组质粒pETDuet-1-α，然后将所述β亚基对应的DNA片段克隆到所述重组质粒pETDuet-1-α载体的多克隆位点1区域以得到所述重组质粒pETDuet-1-α-β。优选的，所述得到所述重组质粒pETDuet-1-α-β之后，还包括：对得到的所述重组质粒pETDuet-1-α-β进行酶切及测序验证。优选的，所述多克隆位点1区域包括双酶切位点EcoRI9和SaLI，所述多克隆位点2区域包括双酶切位点NdeI和XhoI。优选的，所述将所述重组质粒pETDuet-1-α-β和伴侣蛋白表达质粒pGro7共转化到同一宿主细胞中，得到pETDuet-1-α-β-pGro7宿主细胞，包括：先将所述重组质粒pETDuet-1-α-β转化到宿主细胞中，构建pETDuet-1-α-β宿主细胞，使用氨苄霉素筛选阳性菌株，并对所述阳性菌株中的质粒进行测序验证，然后将测序验证正确的阳性菌株制备为感受态细胞，将伴侣蛋白表达质粒pGro7转化到所述感受态细胞中以得到所述pETDuet-1-α-β-pGro7宿主细胞；或者，先将伴侣蛋白表达质粒pGro7转化到宿主细胞中，构建pGro7宿主细胞，然后将所述pGro7宿主细胞制备为感受态细胞，将所述重组质粒pETDuet-1-α-β转化到所述感受态细胞中以得到所述pETDuet-1-α-β-pGro7宿主细胞。优选的，所述宿主细胞为BL21(DE3)。优选的，所述得到所述pETDuet-1-α-β-pGro7宿主细胞之后，还包括：使用氨苄霉素和氯霉素双抗性筛选阳性菌株，并提取所述阳性菌株的质粒进行测序验证，保留验证正确的pETDuet-1-α-β-pGro7宿主细胞。优选的，所述蛋白诱导表达，收集菌体，包括：培养所述pETDuet-1-α-β-pGro7宿主细胞至细胞密度OD680＝0.6-0.8时，加入诱导剂IPTG和阿拉伯糖，于15-37℃诱导表达4-24h，然后离心收集菌体；其中，所述诱导剂IPTG的浓度为0.1-1.0mM。优选的，培养所述pETDuet-1-α-β-pGro7宿主细胞至细胞密度OD680＝0.6-0.8时，加入诱导剂阿拉伯糖和0.5mMIPTG，于16℃诱导表达16h。优选的，所述宿主细胞经超声波破碎后进行蛋白分离纯化，包括：宿主细胞超声波破碎后，离心获取包含蓝藻PDHcE1的上清液，然后使用亲和层析法对所述包含蓝藻PDHcE1的上清液进行蛋白纯化以获得目的蛋白，再使用凝胶排阻层析法对所得目的蛋白进行脱盐处理以除去咪唑。与现有技术相比，本专利技术提供的制备异源四聚体α2β2型蓝藻PDHcE1方法，通过在同一个载体上同时表达蓝藻PDHcE1的α和β亚基的重组质粒，并将重组质粒与伴侣蛋白表达质粒pGro7共转化到同一宿主细胞中，使得蓝藻丙酮酸脱氢酶的α、β亚基与伴侣蛋白在同一宿主细胞本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种制备异源四聚体α

【技术特征摘要】
1.一种制备异源四聚体α2β2型蓝藻PDHcE1方法，其特征在于，所述方法包括：
分别制备蓝藻丙酮酸脱氢酶PDHcE1的α亚基和β亚基所对应的DNA片段，所述α亚基对应的DNA片段如SEQIDNo：1所示，所述β亚基对应的DNA片段如SEQIDNo：2所示；
将所述α亚基对应的DNA片段和所述β亚基对应的DNA片段分别克隆到pETDuet-1载体的多克隆位点1区域和多克隆位点2区域，得到重组质粒pETDuet-1-α-β；
将所述重组质粒pETDuet-1-α-β和伴侣蛋白表达质粒pGro7共转化到同一宿主细胞中，得到pETDuet-1-α-β-pGro7宿主细胞；宿主细胞培养，蛋白诱导表达，菌体收集，超声波破碎后进行蛋白分离纯化，得到异源四聚体α2β2型蓝藻PDHcE1。


2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述将所述α亚基对应的DNA片段和所述β亚基对应的DNA片段分别克隆到pETDuet-1载体的多克隆位点1区域和多克隆位点2区域，得到重组质粒pETDuet-1-α-β，包括：
先将所述α亚基对应的DNA片段克隆到所述pETDuet-1载体的多克隆位点1区域以构建重组质粒pETDuet-1-α，然后将所述β亚基对应的DNA片段克隆到所述重组质粒pETDuet-1-α载体的多克隆位点2区域以得到所述重组质粒pETDuet-1-α-β；或者，
先将所述α亚基对应的DNA片段克隆到所述pETDuet-1载体的多克隆位点2区域以构建重组质粒pETDuet-1-α，然后将所述β亚基对应的DNA片段克隆到所述重组质粒pETDuet-1-α载体的多克隆位点1区域以得到所述重组质粒pETDuet-1-α-β。


3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述得到所述重组质粒pETDuet-1-α-β之后，还包括：对得到的所述重组质粒pETDuet-1-α-β进行酶切及测序验证。


4.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述多克隆位点1区域包括双酶切位点EcoRI9和SaLI，所述多克隆位点2区域包括双酶切位点NdeI和XhoI。


5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述将所述重组质粒pETDuet-1-α-β和伴...

【专利技术属性】
技术研发人员：贺红武，冯江涛，冯玲玲，
申请(专利权)人：华中师范大学，
类型：发明
国别省市：湖北;42