兔源噬菌体展示抗体库构建方法技术

本发明专利技术公开了一种兔源噬菌体展示抗体库构建方法，包括步骤一，利用Trizol法提取免疫兔子脾脏细胞RNA；步骤二，使用反转录试剂盒将脾脏细胞RNA反转录得到单链cDNA；步骤三，抗体轻、重链可变区PCR扩增及scFv片段拼接；步骤四，酶切质粒和PCR拼接产物；步骤五，连接到Pcomb3xss线性化载体，并通过凝胶电泳对连接产物回收纯化；步骤六，电击转化到SS320感受态细胞。本发明专利技术所述方法快速、廉价、获得抗体基因序列后更容易保存、放大生产等优点，比杂交瘤技术制备单克隆抗体技术更方便操作。

【技术实现步骤摘要】
兔源噬菌体展示抗体库构建方法
本专利技术涉及兔源噬菌体抗体库构建技术，具体的涉及一种兔源噬菌体展示抗体库构建方法。
技术介绍
近年来抗体在检测、诊断、治疗等方面发挥了越来越重要的作用。兔单克隆抗体具有比鼠源抗体活性更好且灵敏度更高、比人源抗体更易获得等优点。因为兔源杂交瘤技术当中兔子杂交瘤细胞系不易获得，所以构建免疫噬菌体展示抗体库是目前获得兔源单克隆抗体库比较常用的方法。噬菌体展示抗体库构建完成，可通过panning2-6轮得到单克隆抗体。并且通过噬菌体展示制备单克隆抗体比杂交瘤技术制备单克隆抗体有更多优势，噬菌体展示技术比较快速、廉价、获得抗体基因序列后更容易保存、放大生产等优点。噬菌体展示技术制备单克隆抗体也是基因工程在抗体制备中的应用，是新一代基因工程抗体技术。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种兔源噬菌体展示抗体库构建方法。本专利技术的目的可以通过以下技术方案实现：一种兔源噬菌体展示抗体库构建方法，包括如下步骤：步骤一，利用Trizol法提取免疫兔子脾脏细胞RNA；步骤二，使用反转录试剂盒将脾脏细胞RNA反转录得到单链cDNA；步骤三，抗体轻、重链可变区PCR扩增及scFv片段拼接；S1、抗体轻、重链可变区PCR扩增，并将PCR扩增片段通过凝胶电泳回收纯化；S2、将抗体轻链、重链可变区片段添加linker和相应酶切位点，并将PCR扩增片段通过凝胶电泳回收纯化；S3、将抗体轻链、重链进行拼接，并将PCR扩增片段通过凝胶电泳回收纯化；步骤四，酶切质粒和PCR拼接产物；质粒双酶切20μL酶切反应体系包括：10×FastDigestBuffer2μL、1.0U/μL的两种FastDigestenzyme各1μl、环状质粒1μg、余量为ddH2O；质粒双酶切的条件为：37℃45min、65℃5min、4℃，∝；PCR扩增产物scFv酶切20μL酶切反应体系包括：10×FastDigestBuffer2μL、1.0U/μL的FastDigestenzyme各1μl、0.2μgscFv产物、余量为ddH2OPCR产物scFv酶切条件为：37℃1h、65℃5min、4℃，∝；步骤五，连接到Pcomb3xss线性化载体，并通过凝胶电泳对连接产物回收纯化；步骤六，电击转化到SS320感受态细胞，具体为：取1ug纯化后的连接产物，通过电击转化到200μLSS320电转感受态细胞中。作为本专利技术的进一步方案，步骤三的S1中PCR扩增程序引物序列分别为：重链可变区扩增引物rVHF-15’-CAGTCGGTGGAGGAGTCCRGG-3’rVHF-25’-CAGTCGGTGAAGGAGTCCGAG-3’rVHF-35’-CAGTCGYTGGAGGAGTCCGGG-3’rVHF-45’-CAGSAGCAGCTGRTGGAGTCCGG-3’rVHF-55’-CAGTCGCTGGAGGAGTCCGGGGGT-3’rVHR-15’-CGATGGGCCCTTGGTGGAGGCTGARGAGAYGGTGACCAGGGT-3’rVHR-25’-GACTGAYGGAGCCTTAGGT-3’轻链κ链可变区扩增引物rVLκF-15’-GAGCTCGTGMTGACCCAGACTCCA-3’rVLκF-25’-GAGCTCGATMTGACCCAGACTCCA-3’rVLκF-35’-GAGCTCGTGATGACCCAGACTGAA-3’rVLκF-45’-GCTCAAGTGCTGACCCAGAC-3’rVLκF-55’-GMCMYYGWKMTGACCCAGACTCC-3’rVLκR-15’-ACGTTTGATTTCCACATTGGT-3’rVLκR-25’-ACGTAGGATCTCCAGCTCGGT-3’rVLκR-35’-ACGTTTGACSACCACCTCGGT-3’轻链λ链可变区扩增引物rVLλF-15’-GAGCTCGTGCTGACTCAGTCGCCCTC-3’rVLλF-25’-CAGCCTGTGCTGACTCAGTCG-3’rVLλR-15’-GCCTGTGACGGTCAGCTGGGT-3’rVLλR-25’-CCTGTGACGGTCAGCTGGG-3’。作为本专利技术的进一步方案，步骤三的S1中PCR扩增的50μLPCR反应体系为：5×PrimeSTARBuffer(Mg2+plus)10μL、2.5mMdNTPMixture4μL、10μM/μLPrimerF3μL、10μM/μLPrimerR3μL、2.5U/μLPrimeSTARHSDNAPolymerase0.5μL、cDNA模板2μL、ddH2O27.5μL；PCR扩增程序包括：98℃5s；98℃10s，55℃15s，72℃1min，35个循环；72℃10min；4℃∝。作为本专利技术的进一步方案，步骤三的S2中PCR扩增程序引物序列分别为：rVHF-1+linker5’-gccagaaccgcctcccccactccctccgccaccCAGTCGGTGGAGGAGTCCRGG-3’rVHF-2+linker5’-gccagaaccgcctcccccactccctccgccaccCAGTCGGTGAAGGAGTCCGAG-3’rVHF-3+linker5’-gccagaaccgcctcccccactccctccgccaccCAGTCGYTGGAGGAGTCCGGG-3’rVHF-4+linker5’-gccagaaccgcctcccccactccctccgccaccCAGSAGCAGCTGRTGGAGTCCGG-3’rVHF-5+linker5’-gccagaaccgcctcccccactccctccgccaccCAGTCGCTGGAGGAGTCCGGGGGT-3’rVHR-SpeI-15’-CAGGAAACAGCTATGACactagtCGATGGGCCCTTGGTGGAGGCTGARGAGAYGGTGACCAGGGT-3’rVHR-SpeI-25’-CAGGAAACAGCTATGACactagtGACTGAYGGAGCCTTAGGT-3’rVLκF-SacI-15’-GTAAAACGACGGCCAGTgagctcGAGCTAGTGMTGACCCAGACTCCA-3’rVLκF-SacI-25’-GTAAAACGACGGCCAGTgagctcGAGCTAGATMTGACCCAGACTCCA-3’rVLκF-SacI-35’-GTAAAACGACGGCCAGTgag本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种兔源噬菌体展示抗体库构建方法，其特征在于，包括如下步骤：/n步骤一，利用Trizol法提取免疫兔子脾脏细胞RNA；/n步骤二，使用反转录试剂盒将脾脏细胞RNA反转录得到单链cDNA；/n步骤三，抗体轻、重链可变区PCR扩增及scFv片段拼接；/nS1、抗体轻、重链可变区PCR扩增，并将PCR扩增片段通过凝胶电泳回收纯化；/nS2、将抗体轻链、重链可变区片段添加linker和相应酶切位点，并将PCR扩增片段通过凝胶电泳回收纯化；/nS3、将抗体轻链、重链进行拼接，并将PCR扩增片段通过凝胶电泳回收纯化；/n步骤四，酶切质粒和PCR拼接产物；/n质粒双酶切20μL酶切反应体系包括：/n10×FastDigest Buffer 2μL、1.0U/μL的两种FastDigest enzyme各1μl、环状质粒1μg、余量为ddH

【技术特征摘要】
1.一种兔源噬菌体展示抗体库构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤一，利用Trizol法提取免疫兔子脾脏细胞RNA；
步骤二，使用反转录试剂盒将脾脏细胞RNA反转录得到单链cDNA；
步骤三，抗体轻、重链可变区PCR扩增及scFv片段拼接；
S1、抗体轻、重链可变区PCR扩增，并将PCR扩增片段通过凝胶电泳回收纯化；
S2、将抗体轻链、重链可变区片段添加linker和相应酶切位点，并将PCR扩增片段通过凝胶电泳回收纯化；
S3、将抗体轻链、重链进行拼接，并将PCR扩增片段通过凝胶电泳回收纯化；
步骤四，酶切质粒和PCR拼接产物；
质粒双酶切20μL酶切反应体系包括：
10×FastDigestBuffer2μL、1.0U/μL的两种FastDigestenzyme各1μl、环状质粒1μg、余量为ddH2O；
质粒双酶切的条件为：
37℃45min、65℃5min、4℃，∝；
PCR扩增产物scFv酶切20μL酶切反应体系包括：
10×FastDigestBuffer2μL、1.0U/μL的FastDigestenzyme各1μl、0.2μgscFv产物、余量为ddH2O
PCR产物scFv酶切条件为：
37℃1h、65℃5min、4℃，∝；
步骤五，连接到Pcomb3xss线性化载体，并通过凝胶电泳对连接产物回收纯化；
步骤六，电击转化到SS320感受态细胞，具体为：
取1ug纯化后的连接产物，通过电击转化到200μLSS320电转感受态细胞中。


2.根据权利要求1所述的一种兔源噬菌体展示抗体库构建方法，其特征在于，步骤三的S1中PCR扩增程序引物序列分别为：
重链可变区扩增引物



rVHR-1
5’-CGATGGGCCCTTGGTGGAGGCTGARGAGAYGGTGACCAGGGT-3’
rVHR-25’-GACTGAYGGAGCCTTAGGT-3’
轻链κ链可变区扩增引物



轻链λ链可变区扩增引物





3.根据权利要求2所述的一种兔源噬菌体展示抗体库构建方法，其特征在于，步骤三的S1中PCR扩增的50μLPCR反应体系为：
5×PrimeSTARBuffer(Mg2+plus)10μL、2.5mMdNTPMixture4μL、10μM/μLPrimerF3μL、10μM/μLPrimerR3μL、2.5U/μLPrimeSTARHSDNAPolymerase0.5μL、cDNA模板2μL、ddH2O27.5μL；
PCR扩增程序包括：
98℃5s；98℃10s，55℃15s，72℃1min，35个循环；72℃10min；4℃∝。


4.根据权利要求1所述的一种兔源噬菌体展示抗体库构建方法，其特征在于，步骤三的S2中PCR扩增程序引物序列分别为：
rVHF-1+linker
5’-gccagaaccgcctcccccactccctccgccaccCAGTCGGTGGAGGAGTCCRGG-3’
rVHF-2+linker
5’-gccagaaccgcctcccccactccctccgccaccCAGTCGGTGAAGGAGTCCGAG-3’
rVHF-3+linker
5’-gccagaaccgcctcccccactccctccgccaccCAGTCGYTGGAGGAGTCCGGG-3’
rVHF-4+linker
5’-gccagaaccgcctcccccactccctccgccaccCAGSAGCAGCTGRTGGAGTCCGG-3’
rVHF-5+linker
5’-gccagaaccgcctcccccactccctccgccaccCAGTCGCTGGAGGAGTCCGGGGGT-3’
rVHR-SpeI-1
5’-CAGGAAACAGCTATGACactagtCGATGGGCCCTTGGTGGAGGCTGARGAGAYGGTGACCAGGGT-3’
rVHR-SpeI-2
5’-CAGGAAACAGCTATGACactagtGACTGAYGGAGCCTTAGGT-3’<...

【专利技术属性】
技术研发人员：缪连军，沈健，蒋克雪，
申请(专利权)人：安徽环球基因科技有限公司，
类型：发明
国别省市：安徽;34