一种零背景载体及其制备方法和应用技术

本发明专利技术提供了一种零背景载体及其制备方法和应用，所述零背景载体的毒性基因表达元件包括毒性基因及所述毒性基因的启动子；所述零背景载体的抗毒性基因表达元件包括抗毒性基因及所述抗毒性基因的启动子；所述毒性基因的启动子含有限制性内切酶酶切位点。本发明专利技术的零背景载体在不含有外源基因的条件下，表达的抗毒素不能抑制毒素的毒性，当在毒性基因的启动子插入外源基因后，毒性基因表达量下降，表达的抗毒素抑制了毒素的毒性；此外，本发明专利技术的零背景载体在毒性基因的上下游分别添加原核转录终止子，能够有效抑制抗毒性基因和载体抗性基因造成的通读现象。基于所述零背景载体可以不依赖于IPTG诱导快速筛选得到含有外源基因的阳性克隆。

【技术实现步骤摘要】
一种零背景载体及其制备方法和应用
本专利技术属于生物
，涉及一种零背景载体及其制备方法和应用。
技术介绍
目前，蓝白斑筛选是最常用的区分空载体和阳性克隆载体的方案，该方案中，报告基因LacZα是蓝白斑筛选的标记基因。然而，基于蓝白斑筛选的载体在克隆时存在以下问题：(1)强启动子启动大量外源基因的转录、翻译，导致一些结构复杂的外源基因的转录或翻译产物对宿主有毒性；(2)载体在酶切时残留的限制性内切酶的外切酶活性、酶切载体的反复冻融以及线性化载体的长期保存等因素，使制备的载体在酶切位点缺失1～2个碱基，导致LacZα基因移码突变，使不含外源基因的克隆显白色，产生大量假阳性克隆；(3)当插入的外源性DNA片段较小、未能改变lacZα基因的读码框时，有可能造成平板都是蓝斑的假阴性现象；(4)当载体在平末端克隆大于2kb的外源DNA片段时，白斑较少，增加了挑选阳性克隆的难度。CN108118059A公开了一种改进的启动子及其组成的载体和应用，很好地解决了上述问题，克隆载体在进行克隆时需要使用含IPTG的平板，不含插入序列的空载体在IPTG的诱导下表达大量对大肠杆菌有毒性的ccdB，导致菌体无法生长形成菌落，因此平板上长出的菌落都是含有插入序列的阳性克隆，该技术方案显著简化了分子克隆的步骤，但是IPTG价格昂贵且有毒性，生产成本高、对实验人员有潜在的危害。毒素-抗毒素系统(Toxin-antitoxinsystem，TA系统)普遍存在于细菌的质粒和染色体上，通过表达两种蛋白质从而保证质粒传代的稳定性，一种是稳定的毒性蛋白，另一种是解除毒性蛋白毒性的解毒蛋白，相比于毒性蛋白，解毒蛋白半衰期短，两种蛋白的基因形成一个短的操纵子，它们的表达量是自动调控的。TA系统通过杀死不含质粒的子代细胞，从而保持遗传元件在持续增殖细菌群体中的稳定性。含有TA系统的细菌在丢失质粒后，解毒蛋白由于半衰期短被很快降解，毒性蛋白被释放出来最终导致细胞死亡。随着研究的深入，越来越多的TA系统被发现，例如ccd、parDE、phd/doc、kis/kid、pemI/K、pasABC、hig、ωεζ和yefM/yoeB等。TA系统的功能目前尚未清楚阐明，一种假说认为染色体TA系统通过下调基因的复制和翻译，调节DNA和蛋白的合成效率，帮助细菌解决营养压力的问题；另一种假说认为当一个种群的TA系统通过牺牲群体中其它种群而使自身获益时，TA系统可能诱导程序性死亡。此外，TA系统是促进细菌持续性产生抗生素抗性和毒力的主要因素。因此，TA系统可能在未来成为独特的抗菌靶点。大肠杆菌F质粒的ccd系统(controlcelldeath)是第一个被发现的TA系统。ccd操纵子同时表达不稳定的解毒蛋白ccdA(72个氨基酸)和稳定的毒性蛋白ccdB(101个氨基酸)，其中，ccdA是一种双功能酶，主要功能是中和毒性和自我抑制。在正常的生长条件下，ccdA与ccdB形成紧密的ccdA2-(ccdB2)2复合体，从而抑制ccdB的毒性；当细菌失去质粒后，不稳定的ccdA很快被降解，稳定的ccdB暴露于细胞质基质，捕获大肠杆菌的拓扑异构酶Ⅱ(旋转酶)并破坏其活性，导致细胞发生不可恢复的DNA损伤，最终造成细胞死亡。ccd系统利用ccdA2-(ccdB2)2复合体与操纵子的操纵基因-启动子区域相结合，从而在转录水平进行负性自我调控。当大肠杆菌的拓扑异构酶Ⅱ(旋转酶)A亚基的462精氨酸(arg)突变为半胱氨酸(cys)后，ccdB不会对大肠杆菌产生毒害作用，该突变称为gyrA462，DB3.1大肠杆菌由于含有gyrA462突变因此能够表达ccdB。然而目前TA系统鲜有应用于基因克隆。
技术实现思路
针对现有技术的不足和实际需求，本专利技术提供了一种零背景载体及其制备方法和应用，所述零背景载体具有可调控活性的毒性基因表达元件，在不依赖于IPTG诱导的条件下即可筛选出包含外源基因的阳性克隆。为达此目的，本专利技术采用以下技术方案：第一方面，本专利技术提供了一种零背景载体，所述零背景载体包括毒性基因表达元件和抗毒性基因表达元件；所述毒性基因表达元件包括毒性基因及所述毒性基因的启动子；所述抗毒性基因表达元件包括抗毒性基因及所述抗毒性基因的启动子；所述毒性基因的启动子含有限制性内切酶酶切位点。本专利技术中，零背景载体具有可调控活性的毒性基因表达元件，在不含有外源基因的条件下，毒素的表达量高于抗毒素的表达量，表达的抗毒素不能抑制毒素的毒性，包含零背景载体的重组细胞不能形成克隆；当外源基因插入毒性基因启动子的限制性内切酶酶切位点后，毒性基因的启动子活性显著降低，毒素的表达量也显著降低，表达的抗毒素抑制了毒素的毒性，包含零背景载体的重组细胞形成克隆，基于此原理可以快速筛选得到含有外源基因的阳性克隆，不仅解决了蓝白斑筛选的固有缺陷，而且不依赖于IPTG诱导，显著简化了基因克隆步骤，具有重要的应用前景。优选地，所述毒性基因包括ccdB编码基因，所述抗毒性基因包括ccdA编码基因。优选地，所述限制性内切酶包括EcoRV、AfeI、PmlI、AfeI、NruI、PsiI、ScaI、SmaI、SspI或StuI中的任意一种，优选为EcoRV，ccdB编码基因的启动子中包含限制性内切酶酶切位点，例如可以是GATATC(EcoRV酶切位点)。优选地，所述ccdA编码基因的启动子为组成型启动子，能够启动ccdA编码基因的转录和翻译，表达的ccdA的表达量低于未插入外源基因状态下ccdB的表达量。优选地，所述ccdA编码基因的启动子包括SEQIDNO:5、SEQIDNO:10或SEQIDNO:16所示的核酸序列，表达的ccdA的表达量低于未插入外源基因状态下ccdB的表达量，含有这三种启动子的零背景载体导入宿主细胞后，不能形成克隆，Sanger测序频数为0。优选地，所述零背景载体在ccdB表达元件的上游和下游还包括原核转录终止子，有效抑制了毒性基因和抗毒性基因启动子造成的通读(read-through)现象。优选地，所述零背景载体还包括抗生素抗性基因，优选为卡那霉素抗性基因。优选地，所述零背景载体还包括复制子。优选地，所述零背景载体包括SEQIDNO:20所示的核酸序列，其中，N(18)含有限制性内切酶酶切位点，用于平末端连接外源基因，N(x)为ccdA编码基因的启动子；SEQIDNO:20：ctgctaacaaagcccgaaaggaagctgagttggctgctgccaccgctgagcaataactagcataaccccttggggcctctaaacgggtcttgaggggttttttgctgaaaggaggaactatatccggatgaccgacctgtccggtgccctgaatgaactgcaggacgagtaatcacactggctcaccttcgggtgggcctttctgcgtttattggcgcgtttcggtgatgacggtgaaaacctct本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种零背景载体，其特征在于，所述零背景载体包括毒性基因表达元件和抗毒性基因表达元件；/n所述毒性基因表达元件包括毒性基因及所述毒性基因的启动子；/n所述抗毒性基因表达元件包括抗毒性基因及所述抗毒性基因的启动子；/n所述毒性基因的启动子含有限制性内切酶酶切位点。/n

【技术特征摘要】
1.一种零背景载体，其特征在于，所述零背景载体包括毒性基因表达元件和抗毒性基因表达元件；
所述毒性基因表达元件包括毒性基因及所述毒性基因的启动子；
所述抗毒性基因表达元件包括抗毒性基因及所述抗毒性基因的启动子；
所述毒性基因的启动子含有限制性内切酶酶切位点。


2.根据权利要求1所述的零背景载体，其特征在于，所述毒性基因包括ccdB编码基因，所述抗毒性基因包括ccdA编码基因；
优选地，所述限制性内切酶包括EcoRV、AfeI、PmlI、AfeI、NruI、PsiI、ScaI、SmaI、SspI或StuI中的任意一种，优选为EcoRV；
优选地，所述ccdA编码基因的启动子为组成型启动子；
优选地，所述ccdA编码基因的启动子包括SEQIDNO:5、SEQIDNO:10或SEQIDNO:16所示的核酸序列。


3.根据权利要求1或2所述的零背景载体，其特征在于，所述零背景载体在ccdB表达元件的上游和下游还包括原核转录终止子；
优选地，所述零背景载体还包括抗生素抗性基因，优选为卡那霉素抗性基因；
优选地，所述零背景载体还包括复制子。


4.根据权利要求1-3任一项所述的零背景载体，其特征在于，所述零背景载体包括SEQIDNO:20所示的核酸序列；
优选地，所述零背景载体包括SEQIDNO:21～SEQIDNO:23所示的核酸序列。


5.根据权利要求1-4任一项所述的零背景载体，其特征在于，所述零背景载体包括零背景T载体...

【专利技术属性】
技术研发人员：薛高旭，夏立军，陈业，方其，张艳，吴昕，廖国娟，
申请(专利权)人：苏州金唯智生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32