一种重组类人胶原蛋白工程菌的构建方法技术

本发明专利技术公开一种重组类人胶原蛋白工程菌的构建方法，具体包括：重组类人胶原蛋白基因序列的设计，具体是：以选取的类人胶原蛋白III的氨基酸序列为基础；根据大肠杆菌的偏好密码子设计出编码重组类人胶原蛋白的基因序列；将重组类人胶原蛋白片段与载体的酶切连接，得到酶切产物；将酶切产物用琼脂糖凝胶进行电泳得到目的条带；将目的条带切胶，进行纯化回收得到类人胶原蛋白片段；将类人胶原蛋白片段与载体进行连接得到类人胶原蛋白片段连接产物；将类人胶原蛋白片段连接产物热转化大肠杆菌感受态细胞得到重组类人胶原蛋白工程菌。采用本发明专利技术方法所得重组类人胶原蛋白对人皮肤成纤维细胞和人皮肤角质形成细胞均具有诱导增殖的作用。

【技术实现步骤摘要】
一种重组类人胶原蛋白工程菌的构建方法
本专利技术涉及生物
，特别是涉及一种重组类人胶原蛋白工程菌的构建方法。
技术介绍
胶原蛋白是结缔组织中极其重要的结构蛋白质，对维护细胞、组织及器官的正常生理功能有着重要作用。胶原蛋白被广泛的应用于医学材料及药物方面、美容化妆品、保健品以及各种实用工业中。然而，使用传统方法制备的动物源胶原有一定的病毒隐患如疯牛病、口蹄疫、猪瘟疫等，特别是应用于人体时易引起异体异种的排异反应，从而限制了胶原蛋白在医药方面的应用。人类采用基因工程手段生产重组胶原蛋白，这种生产方法有着传统提取方法难以媲美的优势：1)安全可控，相比于传统胶原制备法原料来源的难以追踪和不确定性，利用基因工程技术生产重组类人胶原蛋白的原料成分明确，无病毒感染风险，2)质量可控，基因工程技术可表达特定分子量的类人胶原片段，批次之间重复性好，而提取的胶原蛋白通常为不同种类胶原蛋白的混合产物，批次之间差异大，不利于质量控制，3)较低的排异反应，类人胶原蛋白以人体胶原蛋白基因为基础构建，其免疫排异反应比动物来源的胶原蛋白小。
技术实现思路
本专利技术设计出独特基因序列(如SEQIDNo.1所示)的重组类人胶原蛋白，结合与pET24a载体的酶切连接得到酶切产物，基于酶切产物获得类人胶原蛋白片段，并将类人胶原蛋白片段与pET-24a载体进行连接得到PET24-类人胶原蛋白片段连接产物，最终基于PET24-类人胶原蛋白片段连接产物获得重组类人胶原蛋白工程菌。采用此种方法获得的重组类人胶原蛋白工程菌经过培养、蛋白诱导表达及纯化后所得纯化的重组胶原蛋白，纯化过程简单且参数容易控制，且所得纯化的重组胶原蛋白对人表皮细胞、人皮肤成纤维原代细胞在72小时内均具有一定的增殖作用，生物活性高。具体技术方案如下：一种重组类人胶原蛋白工程菌的构建方法，包括以下步骤：重组类人胶原蛋白基因序列的设计，具体是：以选取的类人胶原蛋白III的氨基酸序列为基础；根据大肠杆菌的偏好密码子设计出编码重组类人胶原蛋白的基因序列，并在该序列3’端引入组氨酸纯化标签；将重组类人胶原蛋白片段与pET24a载体的酶切连接，得到酶切产物，其中：重组类人胶原蛋白的基因序列如SEQIDNo.1所示；将酶切产物用琼脂糖凝胶进行电泳得到目的条带；将目的条带切胶，进行纯化回收得到类人胶原蛋白片段；将类人胶原蛋白片段测定含量，并将类人胶原蛋白片段与pET-24a载体进行连接得到PET24-类人胶原蛋白片段连接产物；将PET24-类人胶原蛋白片段连接产物热转化大肠杆菌感受态细胞BL21(DE3)得到重组类人胶原蛋白工程菌。优选的，重组类人胶原蛋白的氨基酸序列如SEQIDNo.2所示。优选的，将重组类人胶原蛋白片段与pET24a载体酶切连接时的酶切反应体系如下：含类人胶原蛋白片段的质粒或pET24a质粒：10μl；10×Fastdigestbuffer：10μl；NdeI：5μl；XhoI：5μl；H2O：70μl；37℃，30min。优选的，将酶切产物用1％琼脂糖凝胶进行电泳得到目的条带。优选的，将类人胶原蛋白片段与pET-24a载体进行连接，连接反应体系如下：类人胶原蛋白片段：4μl；pET-24a载体：1μl；T4DNALigase：1μl；10×T4DNALigasebuffer：1μl；水：3μl；25℃，30min。优选的，还包括大肠杆菌的发酵培养、蛋白诱导表达及纯化，具体包括以下步骤：大肠杆菌的发酵培养：将工程细胞株接种于含Kan的LB培养液的离心管中，培养过夜；将过夜培养的菌株接种于含Kan的LB培养液中，振摇至菌体OD600为0.2-0.5；蛋白诱导表达：向剩余的培养物中加入IPTG，振摇3-5h，诱导蛋白表达；蛋白纯化：将过夜培养的菌液接种于新鲜的含Kan的LB培养基中，35℃-40℃培养，振摇至菌体OD600为0.6-0.8；补加IPTG；35℃-40℃诱导表达3-5h；取出培养物，室温离心，弃上清；将菌体沉淀用NativeBinding-Buffer重悬后，超声破碎，3℃-8℃条件下离心，取上清；将上清液加入至Binding-Buffer预平衡的Ni亲和层析柱中，静音混匀仪上旋转混匀；收集流穿液；用NativeWashBuffer洗脱，得到纯化的重组胶原蛋白。优选的，大肠杆菌的发酵培养具体是：将工程细胞株接种于含50μg/mlKan的3ml的LB培养液的离心管中，37℃，220rpm培养过夜；将过夜培养的菌株按1：100接种于50μg/mlKan的10ml的LB培养液中，37℃，220rpm振摇至菌体OD600为0.4，振摇时间为1.8-2.5h。优选的，蛋白诱导表达：向剩余的培养物中加入IPTG至终浓度为0.5-0.8mmol/L，35℃-40℃及220rpm振摇3-6h，诱导蛋白表达；离心收集菌体，用3mlTris缓冲液重悬，超声破菌，收集上清和沉淀，进行SDS-PAGE。优选的，蛋白纯化：将过夜培养的菌液以1：100转接于新鲜的1L含50μg/mlKan的LB培养基中，37℃大量培养，OD600为0.6-0.8，振摇时间为1.8-2.2h，补加IPTG至终浓度为1mM，37℃诱导表达4h；取出培养物，12000g室温离心2min，弃上清；根据镍离子亲和层析柱Ni-NTAAgarose将1L诱导表达的培养菌体沉淀用30ml的NativeBinding-Buffer重悬后，超声破碎，4℃条件下取12000g离心20min，取上清；将上清液10mL加入至Binding-Buffer预平衡的Ni亲和层析柱中，静音混匀仪上旋转混匀15min；收集流穿液；用8mL的NativeWashBuffer以0.5ml/min流速冲洗；用20ml的NativeWashBuffer以1ml/min流速冲洗柱子；用2ml的NativeElution-Buffer、4ml的NativeElution-Buffer及8ml的NativeElution-Buffer以1ml/min流速洗脱目的蛋白，得到纯化的重组胶原蛋白。附图说明图1为实施例1中琼脂糖凝胶电泳检测表达载体酶切结果示意图；图2为实施例1中蛋白诱导表达结果示意图；图3为实施例1中纯化的重组胶原蛋白示意图；图4为实施例1中纯化的重组胶原蛋白48小时对人角质形成细胞HACAT的作用情况；图5为实施例1中纯化的重组胶原蛋白72小时对人角质形成细胞HACAT的作用情况；图6为实施例1中纯化的重组胶原蛋白48小时对人皮肤成纤维原代细胞(fibroblast)的作用情况；图7为实施例1中纯化的重组胶原蛋白72小时对人皮肤成纤维原代细胞(fibroblast)的作用情况；图8为对比例1中BSS蛋白48小时对人角质形成细胞HACAT的作用情况；<本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种重组类人胶原蛋白工程菌的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：/n重组类人胶原蛋白基因序列的设计，具体是：以选取的类人胶原蛋白III的氨基酸序列为基础；根据大肠杆菌的偏好密码子设计出编码重组类人胶原蛋白的基因序列，并在该序列3’端引入组氨酸纯化标签；/n将重组类人胶原蛋白片段与pET24a载体的酶切连接，得到酶切产物，其中：重组类人胶原蛋白的基因序列如SEQ ID No.1所示；/n将酶切产物用琼脂糖凝胶进行电泳得到目的条带；/n将目的条带切胶，进行纯化回收得到类人胶原蛋白片段；/n将类人胶原蛋白片段测定含量，并将类人胶原蛋白片段与pET-24a载体进行连接得到PET24-类人胶原蛋白片段连接产物；/n将PET24-类人胶原蛋白片段连接产物热转化大肠杆菌感受态细胞BL21(DE3)得到重组类人胶原蛋白工程菌。/n

【技术特征摘要】
1.一种重组类人胶原蛋白工程菌的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
重组类人胶原蛋白基因序列的设计，具体是：以选取的类人胶原蛋白III的氨基酸序列为基础；根据大肠杆菌的偏好密码子设计出编码重组类人胶原蛋白的基因序列，并在该序列3’端引入组氨酸纯化标签；
将重组类人胶原蛋白片段与pET24a载体的酶切连接，得到酶切产物，其中：重组类人胶原蛋白的基因序列如SEQIDNo.1所示；
将酶切产物用琼脂糖凝胶进行电泳得到目的条带；
将目的条带切胶，进行纯化回收得到类人胶原蛋白片段；
将类人胶原蛋白片段测定含量，并将类人胶原蛋白片段与pET-24a载体进行连接得到PET24-类人胶原蛋白片段连接产物；
将PET24-类人胶原蛋白片段连接产物热转化大肠杆菌感受态细胞BL21(DE3)得到重组类人胶原蛋白工程菌。


2.根据权利要求1所述的重组类人胶原蛋白工程菌的构建方法，其特征在于，重组类人胶原蛋白的氨基酸序列如SEQIDNo.2所示。


3.根据权利要求1所述的重组类人胶原蛋白工程菌的构建方法，其特征在于，将重组类人胶原蛋白片段与pET24a载体酶切连接时的酶切反应体系如下：
含类人胶原蛋白片段的质粒或pET24a质粒：10μl；
10×Fastdigestbuffer：10μl；
NdeI：5μl；
XhoI：5μl；
H2O：70μl；
37℃，30min。


4.根据权利要求1所述的重组类人胶原蛋白工程菌的构建方法，其特征在于，将酶切产物用1％琼脂糖凝胶进行电泳得到目的条带。


5.根据权利要求1所述的重组类人胶原蛋白工程菌的构建方法，其特征在于，将类人胶原蛋白片段与pET-24a载体进行连接，连接反应体系如下：
类人胶原蛋白片段：4μl；
pET-24a载体：1μl；
T4DNALigase：1μl；
10×T4DNALigasebuffer：1μl；
水：3μl；
25℃，30min。


6.根据权利要求1-5任意一项所述的重组类人胶原蛋白工程菌的构建方法，其特征在于，还包括大肠杆菌的发酵培养、蛋白诱导表达及纯化，具体包括以下步骤：
大肠杆菌的发酵培养：将工程细胞株接种于含Kan的LB培养液的离心管中，培养过夜；将过夜培养的菌株接种于含Kan的LB培养液中，振摇至菌体OD600为0.2-0.5；
蛋白诱导表达：向剩余的培养物中加入IPTG，振摇3-5h，...

【专利技术属性】
技术研发人员：张敏，景成宇，康俪义，刘丽霞，
申请(专利权)人：可孚医疗科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：湖南;43