一种合成抗癌药物中间体的重组大肠杆菌及其构建方法和应用技术

本发明专利技术提供了一种合成抗癌药物中间体的重组大肠杆菌及其构建方法和应用。所述重组大肠杆菌含有的重组质粒携带编码L‑色氨酸氧化酶、CPA合成酶和两种单加氧酶的核苷酸序列；所述L‑色氨酸氧化酶为VioA，所述CPA合成酶为VioB。本发明专利技术中，L‑色氨酸氧化酶、CPA合成酶和两种单加氧酶的组合在大肠杆菌中能够正常表达，并且能够以L‑色氨酸为底物高效合成CPA及抗癌药物中间体，为抗癌药物的筛选和研发提供了基础。

【技术实现步骤摘要】
一种合成抗癌药物中间体的重组大肠杆菌及其构建方法和应用
本专利技术属于分子生物学
，具体涉及一种重组大肠杆菌及其构建方法和应用，尤其涉及一种合成抗癌药物中间体的重组大肠杆菌及其构建方法和应用。
技术介绍
癌症严重威胁人类健康，其诱发因素往往源于信号通路中激酶的异常活化。另外，自身免疫病、神经退行病等常见高发慢性病也与激酶异常密切相关。2001年，第一个激酶抑制剂类药物格列卫(Gleevec)在美获批上市，开启了癌症靶向治疗新时代，疗效显著优于化疗。截至2019年底，FDA共批准了52个激酶抑制剂。虽然数量较多，但由于癌症种类繁多、涉及的异常激酶众多且变异类型多样、以及使用后耐药等因素，癌症在临床上仍存在重大未满足的治疗需求。另外，这些上市药物仅靶向大约25个激酶，仅占人体518个激酶中的5％，尚有大量激酶暂未成药。因此，这类药物研发空间巨大。抗肿瘤新药主要来源于天然产物类似物。因此，有效合成天然产物类似物的创新技术对于新药发现来说至关重要。天然产物往往结构复杂，含有多个手性中心。相对于化学合成，因具有严格的区域和立体选择性，生物合成更有优势。尤其是合成生物学原理与技术的日益成熟，使得天然产物类似物的有效合成易于实现。双吲哚生物碱是一类含有两个吲哚基团的天然产物，代表化合物为具有抗肿瘤活性的星孢菌素(Staurosporine)和蝴蝶霉素(Rebeccamycin)。星孢菌素是一种来源于放线菌的天然产物，具有广谱强效的激酶抑制活性。据不完全统计，星孢菌素能够有效抑制200多种人体激酶，多个激酶的半抑制浓度(IC50)能够达到nM级别。蝴蝶霉素也是一种来源于放线菌的天然产物，具有强效的拓扑异构酶和激酶抑制活性。开发双吲哚生物碱类似物的有效合成技术，是促成这类化合物广泛成药的关键因素。星孢菌素的生物合成基因簇DNA序列在2002年被测定，天然合成酶系被初步识别。随后，多个天然合成酶如StaO、StaD、StaP、StaC等的催化活性在体外生化实验中得到证实，式I显示了星孢菌素的生物合成途径，其中R基团表示＝O或者＝NH，两者可逆。蝴蝶霉素的生物合成基因簇DNA序列也在2002年被测定，天然合成酶系被初步识别，式II显示了蝴蝶霉素的生物合成途径，其中R基团表示＝O或者＝NH，两者可逆。对比式I和式II可知，星孢菌素与蝴蝶霉素的生物合成途径极其相似，其中，StaO与RebO系同工酶，StaD与RebD系同工酶，StaP与RebP系同工酶，但StaC与RebC非同工酶，StaC催化K252c的合成，而RebC催化1,11-二氯-ArcyriaflavinA的合成。基于已鉴定的星孢菌素和蝴蝶霉素的生物合成途径酶系，研究人员在异源宿主白色链霉菌(Streptomycesalbus)体内实现了多个双吲哚生物碱类似物的生物合成，例如，以色氨酸为起始使用酶组合RebO，RebD，RebP和StaC实现了K252c的合成，以色氨酸为起始使用酶组合RebO，RebD，RebP和RebC实现了ArcyriaflavinA的合成，然而，上述组合均在白色链霉菌中表达，且产量均未知。因此，提供一种合成星孢菌素和蝴蝶霉素中间体的生物合成路径和生产菌株对于提高星孢菌素和蝴蝶霉素的产量，以及对抗癌药物的筛选和研发而言具有重要的意义。
技术实现思路
针对现有技术存在的不足，本专利技术的目的在于提供一种合成抗癌药物中间体的重组大肠杆菌及其构建方法和应用。所述重组大肠杆菌能够表达合成抗癌药物中间体的酶组合，所述酶组合能够催化原料L-色氨酸合成相应的药物中间体，进而能够为抗癌药物的筛选和研发提供广阔的应用前景。为达此目的，本专利技术采用以下技术方案：第一方面，本专利技术提供一种重组质粒，所述重组质粒携带编码L-色氨酸氧化酶、CPA合成酶和两种单加氧酶的核苷酸序列；其中，所述L-色氨酸氧化酶为VioA，所述CPA合成酶为VioB。本专利技术中，所述重组质粒能够表达紫色杆菌素(Violacein)、星孢菌素和蝴蝶霉素生物合成途径中的L-色氨酸氧化酶、CPA合成酶以及单加氧酶；并且，所述L-色氨酸氧化酶为VioA，所述CPA合成酶为VioB，相较于天然合成酶系中的StaO/RebO与StaD/RebD，本专利技术中所用的紫色杆菌素生物合成途径中的VioA与VioB具有更高的合成效率，能够高效合成CPA；另外，相较于StaC，本专利技术中所用的SpcC具有更高的合成效率，能够高效合成K252c；同时，所述质粒上含有两种单加氧酶，所述单加氧酶相互配合，能够完成CPA的氧化，得到目标产物K252c和ArcyriaflavinA。作为本专利技术优选的技术方案，所述两种单加氧酶为RebP和SpcC的组合或RebP和RebC的组合。本专利技术中，所述VioA来源于紫色杆菌(Chromobacteriumviolaceum)，氨基酸序列长度为418aa，GenBank编号为AAD51808.1；本专利技术中，所述VioB来源于紫色杆菌(Chromobacteriumviolaceum)，氨基酸序列长度为998aa，GenBank编号为AAD51809.1；本专利技术中，所述RebP来源于扁豆气孔菌(Lentzeaaerocolonigenes)，氨基酸序列长度为397aa，GenBank编号为AAN01211.1；本专利技术中，所述SpcC来源于三链链霉菌(Streptomycessanyensis)，氨基酸序列长度为542aa，GenBank编号为AGL96582.1；本专利技术中，所述RebC来源于扁豆气孔菌(Lentzeaaerocolonigenes)，氨基酸序列长度为529aa，GenBank编号为AAN01210.1。优选地，所述重组质粒携带编码L-色氨酸氧化酶VioA、CPA合成酶VioB、单加氧酶RebP和单加氧酶SpcC的核苷酸序列；或者，所述重组质粒携带编码L-色氨酸氧化酶VioA、CPA合成酶VioB、单加氧酶RebP和单加氧酶RebC的核苷酸序列。本专利技术中，所述酶组合VioA、VioB、RebP和SpcC，与酶组合VioA、VioB、RebP和RebC，构建在同一个质粒上，四种酶虽然来源不同，但是相互之间不会造成影响，均能够正常的执行其生理功能和催化活性，且相互之间存在一定的配合作用，VioA和VioB将原料L-色氨酸氧化并合成CPA，由于CPA的合成效率较高，会使整个生物合成路径进一步向下游进行，RebP和SpcC继续催化CPA形成K252c，RebP和RebC则继续催化合成ArcyriaflavinA；因此，将所述酶组合构建在一个目标质粒上并导入宿主细胞，若宿主细胞能够自发合成L-色氨酸，则所得重组的宿主细胞则能够高效合成抗癌药物中间体K252c或ArcyriaflavinA。作为本专利技术优选的技术方案，所述重组质粒为大肠杆菌表达质粒。优选地，所述大肠杆菌表达质粒包括pETDuet系列、pACYCDuet系列、pRSF本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种重组质粒，其特征在于，所述重组质粒携带编码L-色氨酸氧化酶、CPA合成酶和两种单加氧酶的核苷酸序列；/n其中，所述L-色氨酸氧化酶为VioA，所述CPA合成酶为VioB。/n

【技术特征摘要】
1.一种重组质粒，其特征在于，所述重组质粒携带编码L-色氨酸氧化酶、CPA合成酶和两种单加氧酶的核苷酸序列；
其中，所述L-色氨酸氧化酶为VioA，所述CPA合成酶为VioB。


2.根据权利要求1所述的重组质粒，其特征在于，所述两种单加氧酶为RebP和SpcC的组合或RebP和RebC的组合；
优选地，所述重组质粒携带编码L-色氨酸氧化酶VioA、CPA合成酶VioB、单加氧酶RebP和单加氧酶SpcC的核苷酸序列；或者，
所述重组质粒携带编码L-色氨酸氧化酶VioA、CPA合成酶VioB、单加氧酶RebP和单加氧酶RebC的核苷酸序列。


3.根据权利要求1或2所述的重组质粒，其特征在于，所述重组质粒包括大肠杆菌表达质粒；
优选地，所述大肠杆菌表达质粒包括pETDuet系列、pACYCDuet系列、pRSFDuet系列、pCOLADuet或pCDFDuet系列表达载体中的任意一种，进一步优选为pCDFDuet系列表达载体。


4.根据权利要求1～3任一项所述的重组质粒，其特征在于，所述重组质粒上，编码L-色氨酸氧化酶的核苷酸序列和编码CPA合成酶的核苷酸序列相连，编码单加氧酶的核苷酸序列相连；
优选地，所述核苷酸序列之间通过核糖体结合位点相连。


5.一种重组大肠杆菌，其特征在于，所述重组大肠杆菌包含如权利要求1～4任一项所述的重组质...

【专利技术属性】
技术研发人员：李永安，刁刘洋，周亚维，於四杰，
申请(专利权)人：百缮药业苏州有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32