一种星孢菌素中间体K252c及其衍生物的催化合成体系及催化合成方法技术

本发明专利技术提供了一种星孢菌素中间体K252c及其衍生物的催化合成体系及催化合成方法。所述催化合成体系包括：合成原料L‑色氨酸和/或L‑色氨酸衍生物、L‑色氨酸氧化酶、CPA合成酶、细胞色素P450酶、单加氧酶、辅因子和缓冲液。本发明专利技术中，将L‑色氨酸和/或L‑色氨酸衍生物用作合成原料，逐一或混合加入到合成酶系中进行温育，即可生成一系列结构不同的星孢菌素类似物。该催化合成体系适用于构建星孢菌素类似物库，可从库中筛选出高选择性高活性的化合物，进而开发出安全有效的激酶抑制剂类新药，从而满足癌症病人的需求。

【技术实现步骤摘要】
一种星孢菌素中间体K252c及其衍生物的催化合成体系及催化合成方法
本专利技术属于医药中间体的生物合成
，具体涉及星孢菌素的生物合成，尤其涉及一种星孢菌素中间体K252c及其衍生物的催化合成体系及催化合成方法。
技术介绍
癌症严重威胁人类健康，其诱发因素往往源于信号通路中激酶的异常活化。另外，自身免疫病、神经退行病等常见高发慢性病也与激酶异常密切相关。2001年，第一个激酶抑制剂类药物格列卫(Gleevec)在美获批上市，开启了癌症靶向治疗新时代，疗效显著优于化疗。截至2019年底，FDA共批准了52个激酶抑制剂。虽然数量较多，但由于癌症种类繁多、涉及的异常激酶众多且变异类型多样、以及使用后耐药等因素，癌症在临床上仍存在重大未满足的治疗需求。另外，这些上市药物仅靶向大约25个激酶，仅占人体518个激酶中的5％，尚有大量激酶暂未成药。因此，这类药物研发空间巨大。抗肿瘤新药主要来源于天然产物类似物。因此，有效合成天然产物类似物的创新技术对于新药发现来说至关重要。天然产物往往结构复杂，含有多个手性中心。相对于化学合成，因具有严格的区域和立体选择性，生物合成更有优势。尤其是合成生物学原理与技术的日益成熟，使得天然产物类似物的有效合成易于实现。更重要的是，生物合成也能充分利用化学合成的灵活性，为其提供结构不同的合成原料，从而产生结构不同的非天然类似物。通过构建非天然类似物库，筛选出高选择性高活性化合物，进而可开发出安全有效的激酶抑制剂类新药。星孢菌素(Staurosporine)是一种来源于放线菌的天然产物，具有广谱强效的激酶抑制活性。据不完全统计，星孢菌素能够有效抑制200多种人体激酶，多个激酶的半抑制浓度(IC50)能够达到nM级别。由于选择性不强，此类化合物中，目前只有米哚妥林(Midostaurin)于2017年在美获批上市，用于治疗急性髓性白血病。开发星孢菌素类似物的有效合成技术，构建其类似物库，进而筛选获得高选择性化合物，是促成这类化合物广泛成药的关键因素。由于结构复杂，通过化学手段合成星孢菌素类似物库进行新药发现困难较大。因此，生物合成提供了一种切实可行且有竞争力的技术手段。1997年日本科学家发现了星孢菌素，其生物合成基因簇DNA序列在2002年被测定，天然合成酶系被初步识别。随后，多个天然合成酶如StaO、StaD、StaP、StaC等的催化活性在体外生化实验中得到证实，式I显示了星孢菌素的生物合成途径，其中R基团表示＝O或者＝NH，两者可逆。星孢菌素的核心结构单元是其母核即K252c，其合成原料为L-色氨酸。K252c经糖基化以及甲基化修饰后得到星孢菌素。K252c、HolyrineA等星孢菌素类似物均具有显著的激酶抑制活性。通过遗传修饰星孢菌素的生物合成途径，例如失活或引入特定酶编码基因，便能够在微生物体内合成星孢菌素类似物。然而，这一方法效率低下，构建菌株耗时耗力，且每株菌仅能产生一个或少数几个类似物，难以用于构建数量较大的星孢菌素类似物库。因此，本领域亟需开发一种不仅能够产生星孢菌素的核心结构单元K252c、也能够产生大量K252c类似物的合成路径，来构建数量较大的星孢菌素类似物库。
技术实现思路
针对现有技术存在的不足，本专利技术的目的在于提供一种星孢菌素中间体K252c及其衍生物的催化合成体系及催化合成方法。所述催化合成体系及催化合成方法利用体外酶法合成技术，适用于构建星孢菌素类似物库，可从库中筛选出高选择性高活性的化合物，进而开发出安全有效的激酶抑制剂类新药，从而满足癌症病人在临床上存在的重大治疗需求。为达此目的，本专利技术采用以下技术方案：第一方面，本专利技术提供一种星孢菌素中间体K252c及其衍生物的催化合成体系，所述催化合成体系包括：合成原料L-色氨酸和/或L-色氨酸衍生物、L-色氨酸氧化酶、CPA合成酶、细胞色素P450酶、单加氧酶、辅因子和缓冲液；其中，所述L-色氨酸氧化酶为VioA，所述CPA合成酶为VioB，且所述单加氧酶为SpcC。目前已知的L-色氨酸氧化酶包括天然合成酶StaO及其同工酶如RebO、NokA、SpcO、AtmO或VioA等，已知的CPA合成酶包括天然合成酶StaD及其同工酶如RebD、NokB、SpcD、AtmD或VioB等；然而，并不是所有的已报道的L-色氨酸氧化酶和CPA合成酶在CPA的合成路径中均能起到较好的催化作用；例如AtmO和AtmD，两种酶组合起来并不能催化L-色氨酸得到CPA；且不同的酶与不同的组合在制备过程中的产量均有较大差异。而本专利技术中特异选择的VioA、VioB作为CPA合成路径中的L-色氨酸氧化酶和CPA合成酶，再结合效率较高的单加氧酶SpcC，能够高效催化L-色氨酸和/或L-色氨酸衍生物生成星孢菌素中间体。本专利技术中，将L-色氨酸和化学合成的不同L-色氨酸衍生物用作合成原料，逐一或混合加入到合成酶系中进行一定时间的温育，即可生成一系列结构不同的星孢菌素类似物。所述L-色氨酸氧化酶为VioA，且所述CPA合成酶为VioB，两者组合具有较高的反应效率，为后续细胞色素P450酶和单加氧酶提供反应原料，便于合成星孢菌素中间体K252c及其衍生物。作为本专利技术优选的技术方案，所述细胞色素P450酶包括StaP或RebP。优选地，所述催化合成体系中，所述L-色氨酸氧化酶为VioA，所述CPA合成酶为VioB，所述细胞色素P450酶为RebP，且所述单加氧酶为SpcC。作为本专利技术优选的技术方案，所述辅因子包括还原型辅酶和/或蛋白类辅因子。对于本专利技术而言，反应体系中还原型辅酶和蛋白类辅因子都是必须的，两者同时存在才能使整个酶系具有合成活性。但在具体实验过程中，由于添加的酶液是粗酶液，即细胞裂解液，未经纯化；所以即使在实验过程中不外加还原型辅酶和蛋白类辅因子，酶液中也同时含有这两类辅因子。若额外添加还原型辅酶和/或蛋白类辅因子，会使整个酶系的合成活性会更高。优选地，所述还原型辅酶包括NADH和/或NADPH。优选地，所述蛋白类辅因子包括FldA和/或FnR。优选地，所述催化合成体系中包括辅因子NADPH、FldA和FnR。本专利技术中，所述辅因子的添加能够明显增加K252c的产量，同时，本专利技术中还比较了还原型辅酶Ⅰ(NADH)与还原型辅酶Ⅱ(NADPH)的反应效率，大肠杆菌来源FldA-FnR组合与菠菜来源Ferredoxin-Reductase组合，最终结果可知，辅因子NADPH、FldA和FnR的组合具有最好的辅助效果。本专利技术中，所述反应体系中添加的酶可以是经过纯化或者是未经纯化的酶；当添加粗酶液时，所述酶液中除目的蛋白外，必然含有其他的杂蛋白。本专利技术中以大肠杆菌为宿主生产目的蛋白，以所得粗酶液加入反应体系，各酶液的加入量以其总蛋白在反应体系中的含量进行表示，即酶液的总蛋白含量乘以酶液加入体积与反应体系总体积之比，如下所示：作为本专利技术优选的技术方案，所述催化合成体系中，L-色氨酸氧化酶液的总蛋白质量浓度为2本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种星孢菌素中间体K252c及其衍生物的催化合成体系，其特征在于，所述催化合成体系包括：合成原料L-色氨酸和/或L-色氨酸衍生物、L-色氨酸氧化酶、CPA合成酶、细胞色素P450酶、单加氧酶、辅因子和缓冲液；/n其中，所述L-色氨酸氧化酶为VioA，所述CPA合成酶为VioB，且所述单加氧酶为SpcC。/n

【技术特征摘要】
1.一种星孢菌素中间体K252c及其衍生物的催化合成体系，其特征在于，所述催化合成体系包括：合成原料L-色氨酸和/或L-色氨酸衍生物、L-色氨酸氧化酶、CPA合成酶、细胞色素P450酶、单加氧酶、辅因子和缓冲液；
其中，所述L-色氨酸氧化酶为VioA，所述CPA合成酶为VioB，且所述单加氧酶为SpcC。


2.根据权利要求1所述的催化合成体系，其特征在于，所述细胞色素P450酶包括StaP或RebP；
优选地，所述催化合成体系中，所述L-色氨酸氧化酶为VioA，所述CPA合成酶为VioB，所述细胞色素P450酶为RebP，且所述单加氧酶为SpcC。


3.根据权利要求1或2所述的催化合成体系，其特征在于，所述辅因子包括还原型辅酶和/或蛋白类辅因子；
优选地，所述还原型辅酶包括NADH和/或NADPH；
优选地，所述蛋白类辅因子包括FldA和/或FnR；
优选地，所述催化合成体系中包括辅因子NADPH、FldA和FnR。


4.根据权利要求1～3任一项所述的催化合成体系，其特征在于，所述催化合成体系中，L-色氨酸氧化酶液的总蛋白质量浓度为2～10mg/mL，优选为4～8mg/mL；
优选地，所述催化合成体系中，CPA合成酶液的总蛋白质量浓度为1～8mg/mL，优选为4～6mg/mL；
优选地，所述催化合成体系中，细胞色素P450酶液的总蛋白质量浓度为10～20mg/mL，优选为14～16mg/mL；
优选地，所述催化合成体系中，单加氧酶液的总蛋白质量浓度为30～40mg/mL，优选为33～36mg/mL；
优选地，所述催化合成体系中，所述辅因子NADPH的摩尔浓度为5～15mM，优选为8～12mM；
优选地，所述催化合成体系中，辅因子FldA蛋白液的总蛋白质量浓度为2～6mg/mL，优选为3～5mg/mL；
优选地，所述催化合成体系中，辅因子FnR蛋白液的总蛋白质量浓度为0.5～1.5mg/mL，优选为0.8～1mg/mL。


5.根据权利要求1～4任一项所述的催化合成体系，其特征在于，所述缓冲液包括Tris-HCl缓冲液；
优选地，所述Tris-HCl缓冲液的摩尔浓度为50～200mM；
优选地，所述Tris-HCl缓冲液的pH值为6.8～7.2；
优选地，所述Tris-HCl缓冲液还包括氯化钠；
优选地，所述Tris-HCl缓冲液中氯化钠的摩尔浓度为100～200mM；
优选地，所述缓冲液...

【专利技术属性】
技术研发人员：李永安，刁刘洋，白莉，周亚维，於四杰，
申请(专利权)人：百缮药业苏州有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32