一种促进胶质纤维酸性蛋白在大肠杆菌中大量表达的方法技术

本发明专利技术属于生物技术领域，具体涉及一种促进胶质纤维酸性蛋白在大肠杆菌中大量表达的方法。本发明专利技术通过对胶质纤维酸性蛋白碱基序列的密码子进行优化，优化后的序列信息如SEQ ID NO.2所示，并进一步对pGEX‑4T‑2载体进行改造，增加了ompa信号肽，信号肽序列信息如SEQ ID NO.4所示。通过本发明专利技术提供的方法，使胶质纤维酸性蛋白在大肠杆菌中的分泌增加，改善胶质纤维酸性蛋白包涵体形式的表达。

【技术实现步骤摘要】
一种促进胶质纤维酸性蛋白在大肠杆菌中大量表达的方法
本专利技术属于生物
，具体涉及一种促进胶质纤维酸性蛋白在大肠杆菌中大量表达的方法。
技术介绍
胶质纤维酸性蛋白(GFAP)是中枢神经系统所独有的特异性细胞骨架蛋白，是星形胶质细胞唯一表达的一种标志性蛋白，广泛分布于中枢神经系统各个部位，约占正常成年人脑细胞总数的40％。GFAP则是星形胶质细胞和星形胶质细胞源性肿瘤的标志蛋白，对神经元起支撑和营养作用，参与星形胶质细胞的许多生物学功能，包括细胞的增殖与分裂、维护血脑屏障的正常生理功能、自噬、维持神经递质的平衡等。GFAP是星形胶质细胞特有的中间丝蛋白，是胶质瘤的标志蛋白。在正常情况下，细胞胞质内的GFAP循环降解，血液中GFAP水平较稳定；而病理条件下，如病人的中枢神经系统受到损伤，其星形胶质细胞遭受破伤或坏死时，GFAP从胶质细胞中流出，穿过血脑屏障进入血液中，使GFAP浓度上调，因此GFAP在恶性胶质瘤中表现出异常过度表达。GFAP表达水平异常与多种遗传病和精神病相关，如亚历山大病、唐氏综合征、精神分裂症、情感型双极性疾患和抑郁症。目前，GFAP表达水平已经作为中风、脑外损伤、星型细胞源性胶质瘤等多种疾病的诊断标志之一。另外GFAP主要用于星型胶质瘤，包括星型细胞瘤，星型母细胞瘤，混合胶质瘤，多形性胶质母细胞瘤和非星型细胞瘤，包括部分少数胶质细胞瘤，多数室管膜瘤等中枢神经系统肿瘤的诊断和鉴别诊断。在胶质纤维酸性蛋白抗原的制备过程中，采取pGEX-4T-2载体对其全长基因进行表达，发现其原序列在大肠杆菌中不好表达，为此我们提供了一种经过密码子优化的序列用于表达。此外表达的蛋白都以包涵体形式存在。一方面增加纯化成本，另一方面纯化过程可能造成蛋白失活。
技术实现思路
针对现有技术普遍存在的缺陷，本专利技术提供了一种促进胶质纤维酸性蛋白在大肠杆菌中大量表达的方法。通过本专利技术提供的方法，使胶质纤维酸性蛋白在大肠杆菌中的分泌增加，改善胶质纤维酸性蛋白包涵体形式的表达，为后续的纯化带来很大的便利。为了达到上述目的，本专利技术采用的技术方案为：一种促进胶质纤维酸性蛋白在大肠杆菌中大量表达的方法，包括如下步骤：S1、用软件OptimumGeneTM分析编码GFAP蛋白的基因序列，进行密码子优化，获得优化后的GFAP基因序列；S2、将步骤S1所得优化后的GFAP基因序列导入pGEX-4T-2质粒中，经测序验证序列信息，即可获得构建成功的重组质粒pGEX-4T-2-GFAP-opt；S3、向步骤S2获得的构建成功的重组质粒pGEX-4T-2-GFAP-opt上添加ompa信号肽，进一步酶切测序验证，得到pGEX-4T-2-ompa-GFAP-opt重组质粒；S4、将步骤S3得到的pGEX-4T-2-ompa-GFAP-opt重组质粒转化至宿主菌BL21感受态细胞中，进行蛋白表达，验证，即可。优选地，步骤S1所述的优化后的GFAP基因序列如SEQIDNO.2所示。优选地，步骤S3所述的ompa信号肽序列信息如SEQIDNO.3所示，编码信号肽的核苷酸序列如SEQIDNO.4所示，用引物ompa进行扩增。优选地，所述引物ompa的上游引物序列如SEQIDNO.5所示，所述引物ompa的下游引物序列如SEQIDNO.6所示。优选地，步骤S3的具体过程如下：(1)将pGEX-4T-2-GFAP-opt用限制性内切酶BamHI和EcoRⅠ进行双酶切，获得线性化的pGEX-4T-2-GFAP-opt作为插入载体，然后将酶切产物进行纯化，获得纯化的线性化pGEX-4T-2-GFAP-opt载体；(2)用T4DNA连接酶将ompaDNA片段与步骤(1)所得纯化的线性化pGEX-4T-2-GFAP-opt载体连接，并进一步酶切验证、测序，即可得到pGEX-4T-2-ompa-GFAP-opt重组表达质粒。优选地，步骤(1)中的双酶切过程为，配制20μl的酶切体系：10×酶切Buffer2μl，pGEX-4T-2-GFAP-opt质粒1μg，EcoRI1μl，BamHⅠ1μl，补水至20μl；将上述酶切体系置于37℃下酶切1h即可。优选地，步骤(1)所述的酶切产物纯化过程为：用TAE缓冲液制作1％琼脂糖凝胶，将酶切产物进行电泳，120V，1h；称重空1.5mLEp管，于紫外灯下切下含目的DNA酶切片段的凝胶置入Ep管中；切碎胶块，分析天平称胶块的质量，按100mg＝100μL进行计算胶块的体积；加入至少1倍等体积的BindingBuffer；把混合物置于60℃水浴中温浴7min至凝胶完全融化，其间每隔2-3分钟混匀一次；转移700μl冷却的DNA-琼脂糖溶液到一个SpinColumnsCB2DNA柱子，25℃下，12,000×g离心1min，弃去液体；将柱子重新套回收集管中，加入600μL漂洗液PW至SpinColumnsCB2DNA柱子中，25℃下，12,000×g离心1分钟，弃去滤出液；重复洗涤一次，将空柱子重新套回收集管中，12,000×g离心1min以甩干柱基质残余的液体；把柱子装在一个干净的1.5ml离心管上，加入30～50μl洗脱液或灭菌水上柱子膜上，12,000×g离心1分钟，离心管中的溶液就是纯化的DNA产物，测定DNA浓度并保存于-20℃备用，即可。优选地，步骤(2)所述的连接具体过程如下：按下述配方配制连接体系：10×T4DNALigaseBuffer1μL，线性化的pGEX-4T-2-GFAP-opt1μl，ompaDNA片段7μL，T4DNALigase1μL，混匀，16℃放置16h，然后将连接物转化至DH5α感受态细胞，提取质粒。优选地，步骤(2)中的酶切测序验证过程为：用限制性内切酶BamHI和XhoI酶切pGEX-4T-2-ompa-GFAP-opt质粒，验证用酶切体系为：质粒1μL，BamHI0.3μL，XhoI0.3μL，10×Hbuffer1μL，加入双蒸水至10μL；回收用酶切体系为：质粒DNA16μL，BamHI1μl，XhoI1μL，10×Hbuffer2μL，进行1％琼脂糖凝胶电泳检测酶切产物，进一步测序即可。优选地，步骤S4所述的蛋白表达过程具体包括如下步骤：(1)取1μl溶解的质量浓度为0.2μg/μL的重组质粒加入到制备好的30μl的BL21细菌感受态细胞中，冰上放置30min，获得混合液I；(2)将步骤(1)所得混合液I置于42℃下水浴中热击45s，再放在冰上2min，得混合液II；(3)向步骤(2)所得混合液II中加入700μL不含抗生素的LB液体培养基，置于37℃、200rpm恒温培养振荡器中培养1h，得培养好的混合液；(4)取步骤(3)所得培养好的混合液200μL涂布于含50μg/mL氨苄霉素抗性LB固体平板培养基上，于37℃恒温培养箱内正置培养30min后，倒置平板培养12-16h；(5)挑取阳性单克隆菌落，接种于5ml含50mg/本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种促进胶质纤维酸性蛋白在大肠杆菌中大量表达的方法，其特征在于，包括如下步骤：/nS1、用软件OptimumGene

【技术特征摘要】
1.一种促进胶质纤维酸性蛋白在大肠杆菌中大量表达的方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1、用软件OptimumGeneTM分析编码GFAP蛋白的基因序列，进行密码子优化，获得优化后的GFAP基因序列；
S2、将步骤S1所得优化后的GFAP基因序列插入pGEX-4T-2质粒中，经测序验证序列信息，即可获得构建成功的重组质粒pGEX-4T-2-GFAP-opt；
S3、向步骤S2获得的构建成功的重组质粒pGEX-4T-2-GFAP-opt上添加ompa信号肽，进一步酶切测序验证，得到pGEX-4T-2-ompa-GFAP-opt重组质粒；
S4、将步骤S3得到的pGEX-4T-2-ompa-GFAP-opt重组质粒转化至宿主菌BL21感受态细胞中，进行蛋白表达，验证，即可。


2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S1所述的优化后的GFAP基因序列如SEQIDNO.2所示。


3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S3所述的ompa信号肽序列信息如SEQIDNO.4所示，编码信号肽的核苷酸序列如SEQIDNO.5所示，用引物ompa进行扩增。


4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述引物ompa的上游引物序列如SEQIDNO.6所示，所述引物ompa的下游引物序列如SEQIDNO.7所示。


5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S3的具体过程如下：
(1)将pGEX-4T-2-GFAP-opt用限制性内切酶BamHI和EcoR1进行双酶切，获得线性化的pGEX-4T-2-GFAP-opt作为插入载体，然后将酶切产物进行纯化，获得纯化的线性化pGEX-4T-2-GFAP-opt载体；
(2)用T4DNA连接酶将ompaDNA片段与步骤(1)所得纯化的线性化pGEX-4T-2-GFAP-opt载体连接，并进一步酶切测序，即可得到pGEX-4T-2-ompa-GFAP-opt重组表达质粒。


6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤(1)中的双酶切过程为，配制20μL的酶切体系：10×酶切Buffer2μl，pGEX-4T-2-GFAP-opt质粒1μg，EcoRI1μL，BamHⅠ1μl，补水至20μl；将上述酶切体系置于37℃下酶切1h即可。


7.如权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述的酶切产物纯化过程为：用TAE缓冲液制作1％琼脂糖凝胶，将酶切产物进行电泳，120V，1h；称重空1.5mLEp管，于紫外灯下切下含目的DNA酶切片段的凝胶置入Ep管中；切碎胶块，分析天平称胶块的质量，按100mg＝100μL进行计算胶块的体积；加入至少1倍等体积的BindingBuffer；把混合物置于60℃水浴中温浴7min至凝胶完全融...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐玉艳，
申请(专利权)人：厦门宝太生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：福建;35