一种用于复制性AAV的检测方法技术

本发明专利技术提供了一种不依赖于辅助病毒的rcAAV的细胞学检测方法，所述方法不使用辅助病毒，对环境和检测人员安全友好，并且具有极高的检测灵敏度和准确度，具有广阔的应用前景。

【技术实现步骤摘要】
一种用于复制性AAV的检测方法
本专利技术涉及生物检测领域，更为具体的，本专利技术涉及一种对复制型AAV的检测方法。
技术介绍
复制型AAV(rcAAV)是指含有wtAAVrep和cap基因的载体。当野生型基因存在时，如果存在辅助病毒，AAV将进行复制。除了具有完全复制能力的AAV之外，还检测到仅含有部分AAV野生型基因组的假重组AAV。rcAAV以及假重组AAV是通过ITR和载体质粒上的相邻序列之间和辅助质粒上的病毒序列之间发生同源重组而产生，wtAAV在很大程度上被认为是非致病性的，但是通过rcAAV或假重组AAV潜在的病毒DNA转移会产生具有解旋酶或DNA剪切酶活性的AAVRep蛋白的风险，其衣壳蛋白也有可能会触发细胞毒性T淋巴细胞反应。因此，出于安全考虑，在用于临床应用重组AAV生产中，rcAAV的检测十分必要。目前rcAAV的检测方式大致有两种，其一是在包括腺病毒在内的辅助病毒存在的情况下，感染重组AAV；使用前一轮的细胞裂解液进行多轮感染；使用Southern或qPCR对rep或cap序列进行检测；另一种方式则是不经过放大培养，直接在纯化后的重组AAV产品中进行rep或cap序列PCR检测。两种检测方式都有它们各自的局限性：直接的qPCR检测虽然可以直接检测出产品中包装的野生型AAV的rep或cap序列，但是这并不等同于野生型AAV的存在，绝大多数被包装的序列都是经错误包装的不完整的质粒序列，因此这种方式存在大量的假阳性情况；如果我们把qPCR序列定位于包装质粒经改造过的ITR-P5位置，虽然可以避免假阳性的情况，但是未经过多轮培养放大的过程，难以达到PCR的检测限。而另一种利用辅助病毒共感染的方式，虽然可以解决直接PCR检测所存在的两个缺点，但是因为检测过程中，一直使用野生型腺病毒或HPV的共感染，而腺病毒或HPV对人的易感性和致病性，对检测人员有着一定的感染风险，相应对培养环境的要求也很高。
技术实现思路
为了克服现有技术中存在的缺陷，本专利技术提供了一种不依赖于辅助病毒的rcAAV的细胞学检测方法，所述方法不使用辅助病毒，对环境和检测人员安全友好，并且具有极高的检测灵敏度和准确度。本专利技术的第一个方面，提供一种不依赖于辅助病毒的检测rcAAV的方法，所述方法包括如下步骤，A.细胞的转染和感染:第1轮感染使用pHelper质粒和pRC8质粒转染细胞，转染后感染待测rcAAV，感染2-3天后收集培养基上清，将所述上清与培养基混合后加入第2轮待感染细胞；优选的，待检测的rcAAV包含病毒衣壳和包含两端ITR的病毒基因组DNA。第2-N轮感染使用pHelper质粒和pRC8质粒转染细胞，转染后感染混合有培养基的上一轮细胞培养基上清，感染2-3天后再次收集培养基上清，将所述上清与培养基混合后加入下一轮待感染细胞；B.用DNaseI处理待测步骤A最终获得的细胞培养基上清；C.利用taqmanqPCR技术检测感染的细胞培养基上清中的rcAAV。优选的，步骤A中所述N＝2-5。在一种实施方式中，所述细胞为可包装和感染重组AAV病毒的细胞，如293细胞、CHO细胞、HeLa细胞等。在另一种实施方式中，步骤B包括如下步骤：在EP管中配置2ⅹDNaseImix，加入无核酶水、2ⅹDNaseIBuffer、100U/mlDNaseI，吹吸混匀后依次加入待测样品，得到2倍稀释样品1，PCR仪上37℃放置30min；75℃放置15min。处理后样品涡旋混匀，瞬时离心，离心后取稀释样品1加入无核酶水，将其稀释为20倍稀释样品2，涡旋混匀，瞬时离心。在另一种实施方式中，步骤C中taqmanqPCR所用的引物和探针序列如下所示：rcAAVprimerSET：ITR-P5-taqFAGTGGCCAACTCCATCACTAITR-P5-taqRCCTCTAATACAGGACCTCCCTAACITR-P5-probeCGTAATTCACGTCACGACTCCACCCBGHprimerSET：BGH-FCCAGCCATCTGTTGTTTGCCBGH-RACTCAGACAATGCGATGCAATBGH-ProbeCCCGTGCCTTCCTTGACCCT在另一种实施方式中，步骤C中taqmanqPCR配置体系为：2*AceQqPCRprobemastermix10ul50*ROXreferenceDye10.4ulPrimerF(10uM)0.4ulPrimerR(10uM)0.4ulTaqmanprobe(100uM)0.02ulTemplateDNA2ulddH2O6.8ulTotal20ul本专利技术的第二方面，提供一种用于检测rcAAV的试剂盒，所述试剂盒包括表达腺病毒辅助蛋白的细胞、pHelper质粒和pRC8质粒。更为优选的，所述试剂盒还包括用于PCR检测的引物和探针。附图说明附图用来提供对本专利技术的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本专利技术的实施例一起用于解释本专利技术，并不构成对本专利技术的限制。在附图中：图1为本专利技术实施例1中转染和感染实验流程图；图2为本专利技术实施例3中qPCR检测结果图(利用重组AAV基因组上的BGH来表征重组AAV的表达滴度)；图3为本专利技术实施例3中qPCR检测结果图(利用野生型AAV基因组上的P5-ITR来表征可复制型AAV的表达滴度)。具体实施方式以下结合附图对本专利技术的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本专利技术，并不用于限定本专利技术。实施例1：HEK293T细胞的转染和感染第一轮感染实验过程：1.Day1.提前24小时消化HEK293T细胞，计数，按照每孔1×106细胞/2ml铺至6孔板(100ug/ml多聚赖氨酸-PBS溶液预处理10min)，共4孔。另外1×106细胞铺至6cmdish传代。37℃培养过夜。2.Day2.4个孔细胞，2个孔为复孔。其中2个孔转染2ugpHelper质粒，另外两个孔转染1ugpHelper+1ugpRC8质粒。3.Day3.感染待测重组AAV病毒。4.Day4.PBS洗一次，换1.5ml新鲜DMEM-10％FBS培养基。5.Day5.收集培养基上清于1.5mlEP管，室温离心1000rpm，5min，除去细胞和细胞碎片。取100ul上清冻存-80℃留作检测样品；1ml上清与1ml新鲜DMEM-10％FBS培养基混合后加入第二轮待感染细胞。第2-N轮感染实验过程(1＜N≤5)：1.Day1.提前24小时消化HEK2本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种不依赖于辅助病毒的rcAAV的细胞学检测方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤，/nA.细胞的转染和感染:/n第1轮感染使用pHelper质粒和pRC8质粒转染细胞，转染后感染待测重组AAV病毒，感染2-3天后收集培养基上清，将所述上清与培养基混合后加入第2轮待感染细胞；/n第2-N轮感染使用pHelper质粒和pRC8质粒转染细胞，转染后感染混合有培养基的上一轮细胞培养基上清，感染2-3天后再次收集培养基上清，将所述上清与培养基混合后加入下一轮待感染细胞；/nB.用DNase I处理待测步骤A最终获得的细胞培养基上清；/nC.利用taqman qPCR技术检测感染的细胞培养基上清中的rcAAV。/n

【技术特征摘要】
1.一种不依赖于辅助病毒的rcAAV的细胞学检测方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤，
A.细胞的转染和感染:
第1轮感染使用pHelper质粒和pRC8质粒转染细胞，转染后感染待测重组AAV病毒，感染2-3天后收集培养基上清，将所述上清与培养基混合后加入第2轮待感染细胞；
第2-N轮感染使用pHelper质粒和pRC8质粒转染细胞，转染后感染混合有培养基的上一轮细胞培养基上清，感染2-3天后再次收集培养基上清，将所述上清与培养基混合后加入下一轮待感染细胞；
B.用DNaseI处理待测步骤A最终获得的细胞培养基上清；
C.利用taqmanqPCR技术检测感染的细胞培养基上清中的rcAAV。


2.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤A中所述N＝2-5。


3.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤B包括如下步骤：
在EP管中配置2ⅹDNaseImix，加入无核酶水、2ⅹDNaseIBuffer、100U/mlDNaseI，吹吸混匀后依次加入待测样品，得到2倍稀释样品1，PCR仪上37℃放置30min；75℃放置15min；处理后样品涡旋混匀，瞬时离心，离心后取稀释样品1加入无核酶水，将其稀释为20倍稀释样品2，涡旋混匀，瞬时离心。


4.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤C中taqmanqPCR所用的引物和探针序列如下所示：
rcAAVprimerSET：
ITR-P5-taqFAGTGGCCAACTCCATCACTA
ITR-P5-taqRCCTCTAATACAGGACCTCCCTAAC
ITR-P5-probeCGTAATTCACGTCACGACTCCACCC
BGHprimerSET：
BGH-FCCAGCCATCTGTTGTTTGCC
BGH-RACTCAGACAATGCGATGCAAT
BGH-ProbeCCCGTGCCTTCCTTGACCCT。


5.如权利要求1所述的检...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈邵宏，郝丹丹，史天永，和赛超，牛琳琳，
申请(专利权)人：北京中因科技有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11