一种细胞内As制造技术

高毒性重金属引发的环境和水体污染一直是人类面临的严重问题。As

【技术实现步骤摘要】
一种细胞内As3+、Pb2+和Hg2+的同时荧光成像方法
本专利技术涉及As3+、Pb2+、Hg2+的同时检测与成像，具体涉及一种采用纳米胶囊-核酸生物分子复合物进行细胞内As3+、Pb2+和Hg2+的同时荧光成像，属于环境监测及纳米生物

技术介绍
高毒性重金属引发的环境和水体污染一直是人们关心的主要问题，高毒性重金属可以通过空气、水体和土壤进入食物链严重危害生态系统。砷是一种自然界中广泛存在的、具有类金属特性的元素。砷及其化合物已被世界卫生组织(WHO)下属的国际癌症研究机构和美国环保署(EPA)等诸多国际权威机构公认为致癌物。砷污染主要来自于农药、化肥、冶金、采矿、制药等行业的三废排放。砷在水环境中的主要存在形式是H3AsO3中的As(Ш)和H3AsO4中的As(V)，其中，As(Ш)毒性最高，是As(V)毒性的100倍，慢性摄入或长期接触砷会使其大量沉积在人体皮肤、肺、膀胱、肝和肾中，引发肺癌、皮肤癌等多种癌变，同时还会导致心血管疾病和人体循环系统的损害。由于砷污染的进一步扩大，人类正面临严峻的砷中毒威胁，砷污染导致的以皮肤和内脏疾病为主的健康危害已在全世界范围内受到广泛关注。为此，美国环境保护署最近重新调整了饮用水中的砷含量从50μg/L到10μg/L。该变化促使更多的研究人员开发出能够高灵敏检测砷的技术以满足这一新的标准。严重危害人类健康和环境的重金属还包括铅，铅污染主要来源于人类生活及化工生产等相关领域，涉及油漆、涂料、蓄电池、冶炼、电镀、餐具、燃煤、自来水管、化妆品、染发剂等产品。铅是一种潜在的神经毒素，也是普遍存在于自然界的重金属污染中毒性较大的一种。对环境和人体健康产生严重的影响，一旦进入人体将很难排除，直接损害人的脑细胞。即使暴露于非常低水平的铅离子浓度(血液中<100μg/L)下也会引起多种疾病，包括记忆力减退、易怒、贫血、肾损伤和智力低下等，造成各种神经毒性作用，引发神经系统、心血管系统损伤和发育障碍，特别是对于生长发育期的儿童来说，危害尤为巨大。铅可经呼吸吸入、食物和饮水摄入、经皮肤吸收。铅的毒性作用没有阈值性，即体内有铅便有毒，因此，“零血铅”已成为临床控制儿童铅中毒的目标。除了砷和铅以外，金属汞也是一种具有严重毒性且分布广泛的重要环境污染物，即使在低浓度下也会对环境和人类构成严重威胁，造成严重的、永久的损害。Hg2+废水污染物是构成水体污染的重要组成部分，排入水中的无极汞污染物不能被生物降解，而是参与食物链循环，可被微生物转化为毒性更强的甲基汞，在生物体内大量富集后经过食物链(尤其是鱼类)进入人体，严重威胁着人类的健康，可造成中枢神经系统、内分泌系统及脑部的损害，此外，它可能还会破坏人体免疫系统，甚至导致死亡。为此，美国环境保护署提出了饮用水中汞的最大容许值为10nM。因此，建立灵敏、准确、高效的可同时检测As3+、Pb2+、Hg2+的分析方法对于环境监测、食品安全和生物医药等领域至关重要。目前，用于同时检测As3+、Pb2+、Hg2+的检测方法非常少，远远少于单个离子的检测方法。对于单一金属离子的检测，传统技术主要包括电感耦合等离子体质谱法(ICP-AES)、原子吸收/发射光谱法和极谱法等方法。但是，这些方法常常需要复杂的专业操作、耗时的分析和贵重的仪器设备等，限制了它们在资源有限的环境中的使用。由于荧光传感技术具有灵敏、简单、快捷等优点而得到日益广泛的研究。不可否认，文献报道的方法存在检测灵敏度不高、选择性不强等问题。为了克服这些缺点，迫切需要开发出既简单、灵敏、又经济、高效的测定方法来满足环境、生物、医药等领域对于As3+、Pb2+、Hg2+的同时检测的需求。据文献报道，当金属离子进入错配的DNA碱基对时，金属离子和DNA碱基对之间会产生一种吸引力，将它们结合在一起。例如，Hg2+能够选择性地识别胸腺嘧啶碱基并形成强而稳定的胸腺嘧啶-Hg2+-胸腺嘧啶配位复合物。与汞离子类似，铅离子也能够特异性地和核苷酸发生作用，由于富含鸟嘌呤碱基的核酸分子对铅离子具有很强的亲和力，通过特异性的配位作用与铅离子结合而形成结构稳定的Pb2+-G-四链体，可以实现对铅离子高选择性、高灵敏的检测。对于As3+而言，可以与其核酸适配体特异性结合，但有关适配体的报道比较少见。正是由于As3+对核酸适配体、Hg2+和Pb2+分别对富含胸腺嘧啶、鸟嘌呤碱基的功能核酸分子的亲和力高、特异性强的识别作用而形成结构稳定的金属离子-核酸分子配位复合物，该作用对于这3种金属离子的高灵敏、高特异性检测具有重要意义。本专利技术根据As3+、Hg2+和Pb2+的这一反应特性，将其分别与核酸适配体、富含胸腺嘧啶、鸟嘌呤的核酸生物分子相结合，巧妙地应用到具有中空、多孔结构的纳米材料领域，同时，为了进一步提高As3+、Hg2+和Pb2+的检测灵敏度，在生物识别技术的基础上，又结合了生物酶的剪切作用，使靶标As3+、Hg2+和Pb2+得到循环利用，最终使检测信号得到显著放大，为As3+、Hg2+和Pb2+的同时、高灵敏检测提供了新型、特异、高效的检测技术。迄今为止，采用中空多孔纳米材料、利用多种功能核酸生物分子构建纳米胶囊-核酸生物分子复合物用于细胞内As3+、Hg2+和Pb2+的同时荧光成像技术还未见文献报道。
技术实现思路
为了克服现有技术存在的不足，针对基于多种功能核酸生物分子识别技术的纳米胶囊-核酸生物分子复合物用于同时检测As3+、Hg2+和Pb2+的技术未见报道，因此，本专利技术的第一目的：提出并构建一种新型的可同时检测As3+、Hg2+和Pb2+的纳米胶囊-核酸生物分子复合物，具体是利用中空、多孔的纳米金作为纳米胶囊，分别筛选、设计并合成易于修饰、方便合成的、可被As3+、Hg2+和Pb2+识别的核酸生物分子，并将其分别组装到纳米胶囊表面，一方面作为堵孔材料用于封堵纳米胶囊的孔口，防止孔内物质的外泄；另一方面分别作为As3+、Hg2+和Pb2+的识别分子可与As3+、Hg2+和Pb2+发生特异性的识别反应，其中，Hg2+和Pb2+可分别形成T-Hg2+-T碱基对复合物、Pb2+-G-四链体复合物，在形成金属离子-核酸分子配位复合物的同时发生构象转化而脱离纳米胶囊表面，从而使封堵的孔口被打开，纳米胶囊内的染料分子得以释放，分离上清液，在一定波长的激发光照射下产生荧光信号，根据荧光发射信号的强弱实现对As3+、Hg2+和Pb2+的同时检测。在本专利技术中，为了进一步提高同时检测As3+、Hg2+和Pb2+的灵敏度，在分子识别的基础上，本专利技术又利用外切酶的剪切作用实现了荧光信号的循环放大。该循环放大技术利用了核酸外切酶可对具有双链结构的金属离子-核酸生物分子配位复合物进行剪切的作用，将As3+、Hg2+和Pb2+释放，释放出来的As3+、Hg2+和Pb2+能够再次与纳米胶囊表面的生物识别分子发生识别反应，然后再次被剪切……，循环往复，结果使As3+、Hg2+和Pb2+得到多次循环利用，更多的孔口被打开，释放出更多的孔内物质。正是由于剪切酶的作用，As3+、Hg2+和Pb2+被本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种细胞内As

【技术特征摘要】
1.一种细胞内As3+、Pb2+和Hg2+的同时荧光成像方法，其特征在于该方法采用了一种由3种核酸生物识别分子、3种荧光信号分子和具有中空、多孔结构的纳米金构建而成的纳米胶囊-核酸生物分子复合物。


2.一种如权利要求1所述的细胞内As3+、Pb2+和Hg2+的同时荧光成像方法，其特征在于：所述的3种核酸生物识别分子分别是5’-GGTAATACGACTCACTATAGGGAGATACCAGCTTATTCAATTTTACAGAACAACCAACGTCGCTCCGGGTACTCCTTCTTCATCGAGATAGTAAGTGCAATCC-3’、5’-GGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGG-3’和5’-TTTGTTTGTTGGCCCCCCTTCTTTCTTA-3’。


3.一种如权利要求1所述的细胞内As3+、Pb2+和Hg2+的同时荧光成像方法，其特征在于：所述的3种荧光信号分子分别是荧光素Cy5、RhB和异硫氰酸荧光素FITC。


4.一种如权利要求1所述的细胞内As3+、Pb2+和Hg2+的同时荧光成像方法，其特征在于：所述的3种核酸生物识别分子是通过静电作用被分别组装到具有中空、多孔结构的纳米金表面。


5.一种如权利要求1所述的细胞内As3+、Pb2+和Hg2+的同时荧光成像方法，其特征在于步骤如下：
(1)取适量细胞悬浮液，用含有As3+、Pb2+和Hg2+的溶液对细胞进行培养后离心，移除上清液；
(2)加入本发明提出的纳米胶囊-核酸生物分子复合物溶液进行孵育，10-50min后分别给予相应波长的激发进行细胞内As3+、Pb2+和Hg2+的荧光成像；
其中，所述的纳米胶囊-核酸生物分子复合物的制备方法，步骤如下：
(1)分别筛...

【专利技术属性】
技术研发人员：王卫，侯晓珊，王世颖，万均，宋志灵，罗细亮，
申请(专利权)人：青岛科技大学，
类型：发明
国别省市：山东;37