一种含有花菁类化合物的编码微球及其制备方法和应用技术

本申请涉及荧光编码微球技术领域，公开了一种含有花菁类化合物的编码微球及其制备方法和应用。一种含有花菁类化合物的编码微球，所述编码微球包括：花菁类化合物、微球、封闭层，花菁类化合物在微球内部，封闭层在最外层。其制备方法，包括以下步骤：将微球分散于溶剂，得到微球悬浮液；将花菁类化合物溶解于溶剂，得到染料溶液；将染料溶液加入微球悬浮液中；包覆封闭层。含有花菁类化合物的编码微球在制备检测抗原/抗体和核酸的生物检测试剂中的应用。本申请通过控制花菁类化合物的加入量或加入化合物的个数，得到一系列荧光强度不同的编码微球，最终制得的编码微球荧光变异系数（CV值）好，编码范围大。

【技术实现步骤摘要】
一种含有花菁类化合物的编码微球及其制备方法和应用
本申请涉及花菁类化合物的新用途领域，尤其是涉及含有花菁类化合物的编码微球及其制备方法和应用。
技术介绍
荧光编码微球(又称为荧光标记微球)技术，已被广泛用于在免疫和核酸等项目的多指标联检。其工作原理是：采用高分子微球作为染料的免疫吸附分析的固态载体，通过使用不同波长的荧光物质或用同一荧光物质的不同浓度对微球进行染色标记，使微球具有独特的荧光信号编码，再在微球表面偶联特异性抗原/抗体或DNA片段每种光学信号的微球指向一种特异性的分析物，混合后可用于多重检测。用于编码微球的荧光物质主要有荧光染料和量子点，是现在研发的热点，本申请主要研究的是荧光染料。花菁类化合物(又称为花菁类染料)具有吸收系数高、荧光量子产率高、吸收波长和发射波长能够在红外/近红外相对较长波长光谱区域等优良的光学性能，使得该类化合物广泛用于光盘制作、生物分子标记等领域中。尽管花菁类化合物应用领域很多，但是对于编码微球来说，荧光染料的筛选条件要求很高，比如：①染料能够与微球结合，且在微球制备过程中不会发生明显的光谱变化；②染色均一性好；③染料的光谱特性满足检测需求；包括：最大吸收峰和发射峰与流式检测系统的激光器和滤色通道相匹配，有较窄的发射光谱，与其他滤色通道尤其临近通道有很低的光谱重叠等；④编码微球的生物应用端常用PE作为报告分子(由于PE具有很高的量子效率)，因此，编码微球的信号与PE检测通道无串扰为应用端的一个切实需求。由于荧光染料进入微球后，单一或多种不同的荧光染料会产生染料能量转移、重吸收等复杂的现象，造成微球的荧光信号与发光材料之间的荧光信号呈现非正交的关系。因此，编码微球后的编码信号无法预测，无法准确设计，荧光信号的均一性以及编码数量也受到限制，这些都为荧光染料的选择增加了难度。
技术实现思路
为了寻求一种编码性能好、光谱匹配以及性能稳定的编码微球，本申请提供了一种含有花菁类化合物的编码微球及其制备方法和应用。第一方面，本申请提供一种含有花菁类化合物的编码微球，采用如下的技术方案：一种含有花菁类化合物的编码微球，所述编码微球包括：花菁类化合物、微球、封闭层，花菁类化合物吸附在微球内部，封闭层包覆在微球的表面。通过采用上述技术方案，花菁类化合物的一种或多种存在于微球内部，以非化学键的方式结合在微球内部，如物理吸附、亲疏水性作用；通过对花菁类化合物加入的量进行调控，能够得到一系列不同荧光信号强度的微球群，从而使每种微球群都有独特的光学信号标记，实现对微球的光学编码；并且微球的整个三维体积中均可结合花菁类化合物，从而微球内结合的花菁类化合物含量范围更大，该编码微球的编码范围更大；本申请的编码微球的最大发射波长在红光/近红外区域，尤其是650-800nm区域。在临近的橙光区域，在560-610nm波长附近串扰低。此外，荧光信号均一性好，信号强度变异系数(CV)的范围在3-15％内；封闭层的作用是将染料包裹在微球内部，避免发生泄漏，并防止与外界环境接触引起染料化学性质或光学性质的变化，微球的稳定性更好。优选的，所述微球为聚合物微球。所述聚合物微球由苯乙烯、丙烯酸、丙烯氰、丙烯酸胺、甲基丙烯酸甲酯、氯乙烯、乙烯基苄基氯、醋酸乙烯酯、乙烯基甲苯、乙烯基吡啶、二乙烯基苯、丁二烯或异戊二烯等中的一种或几种单体聚合而成。优选的，所述微球具有介孔结构。可选的，所述微球还可以含有磁性材料，所述磁性纳米材料为Fe3O4,、γ-Fe2O3或MFe2O4中至少一种，其中M为Co、Ni、Mn、Mg或Zn中至少一种。优选的，所述微球直径为0.5-40μm。优选的，所述微球直径为3μm-15μm。优选的，所述微球直径的变异系数为1-5％优选的，所述微球孔径为1-100nm。优选的，所述微球孔径为5-50nm。通过采用上述技术方案，该尺寸适合流式检测系统的检测尺寸范围(0.5μm-40μm)，同时能够在溶液中保持一定的悬浮性以及生物检测的灵敏度；微球直径过小，则表面积小，可结合的抗体等生物分子数量少，影响检测灵敏度，而微球直径过大，微球过沉，影响微球的悬浮性。在该微球直径和孔径范围限定下的任一尺寸下，微球群中不同微球的直径和孔径一致性越高，其微球中标记的花菁类化合物的含量一致性越高，信号强度变异系数(CV)越小。优选的，所述封闭层厚度为20-800nm。优选的，所述封闭层厚度为23-750nm。优选的，所述封闭层厚度为50-500nm。优选的，所述封闭层为硅烷化试剂在微球表面进行缩聚反应形成。所述硅烷化试剂包括原硅酸酯、氨基硅烷、环氧硅烷、醛基硅烷中的任意一种或多种。可选的，所述封闭层是经过官能化处理的。可选的，所述官能团为羟基、羧基、氨基、醛基、巯基、环氧基、叠氮、炔基等。可选地，官能团为羧基，能够与抗体中的氨基基团进行共价连接，也可与修饰有氨基的寡核苷酸片段连接。可选的，所述官能团是为了能够与生物分子共价连接用于生物检测。例如官能团为羧基时，其能与抗体或抗原中的氨基基团进行共价连接，也可与修饰有氨基的寡核苷酸片段连接。例如：常用N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)活化羧基再进一步与氨基进行共价连接反应。可选的，所述花菁类化合物为具有式Ⅰ结构的化合物：式Ⅰ中：X选自氧原子、硫原子、硒原子或低级烷基取代的碳原子；Y为Z-为负离子；Ar1,Ar2各自独立为芳香环；R1和R2各自独立为氢原子、烷基、有羟基的烷基链、有醚基的烷基链、有酯基的烷基链、有酰基的烷基链或者有取代基的苄基。优选的，式中：X为-C(CH3)2。Z-为卤离子、卤化硼离子、磷化物离子、卤氧酸盐离子、氟硫酸离子、甲硫酸离子及苯中有卤原子或卤烷基作为取代基的四苯基硼化物离子；卤离子为F-、Cl-、Br-或I-；卤化硼离子为BF4-、BCl4-或BBr4-。Z-优选为Br-，I-或BF4-。Ar1和Ar2各自独立为苯基或萘基。R1和R2各自独立选自直链或支链的C1-22的烷基，C1-10COOR3、C1-10烷基OR4；R3和R4各自独立为H、C1-4烷基或苯基。进一步优选，式中：Z-为Br-或I-。R1和R2各自独立选自饱和或不饱和链的C1-10烷基、C1-10烷基OR4。R4为H或C1-4烷基。通过上述方案，本申请中涉及的花菁类化合物为疏水性染料，在制备溶剂中分散性好，且很容易进入到聚合物微球内部。可选的，花菁类化合物具体为：通过采用上述技术方案，化合物Ⅰ-Ⅴ编码的微球，其最大发射波长在红光区域，可以被红色激光器(激发波长633nm/635nm/638本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种含有花菁类化合物的编码微球，其特征在于：所述编码微球包括：花菁类化合物、微球、封闭层，/n花菁类化合物吸附在微球内部，封闭层包覆在微球的表面。/n

【技术特征摘要】
20210514 CN 20211052472991.一种含有花菁类化合物的编码微球，其特征在于：所述编码微球包括：花菁类化合物、微球、封闭层，
花菁类化合物吸附在微球内部，封闭层包覆在微球的表面。


2.根据权利要求1所述的一种含有花菁类化合物的编码微球，其特征在于：所述微球为聚合物微球。


3.根据权利要求1所述的一种含有花菁类化合物的编码微球，其特征在于：所述封闭层为硅烷化试剂在微球表面进行缩聚反应形成的。


4.根据权利要求1所述的一种含有花菁类化合物的编码微球，其特征在于：所述封闭层是经过官能化处理的。


5.根据权利要求1-4任一所述的一种含有花菁类化合物的编码微球，其特征在于：所述花菁类化合物具有式Ⅰ所示的结构：



式I中：
X选自氧原子、硫原子、硒原子或低级烷基取代的碳原子；
Y为CH-CH＝CH,
Z-为负离子；
Ar1,Ar2各自独立为芳香环；
R1和R2各自独立为氢原子、烷基、有羟基的烷基链、有醚基的烷基链、有酯基的烷基链、有酰基的烷基链或者有取代基的苄基。


6.根据权利要求5所述的一种含有花菁类化合物的编码微球，其特征在于：所述花菁类化合物选自：

【专利技术属性】
技术研发人员：刘燕，徐兵，马永波，
申请(专利权)人：北京指真生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11