一种内切褐藻胶裂解酶、其编码基因及其制备方法和应用技术

本发明专利技术属于微生物基因工程领域，具体涉及一种黄杆菌属来源的内切褐藻胶裂解酶、其编码基因及其表达蛋白的制备方法和应用。本发明专利技术褐藻胶裂解酶AlgN15来源于黄杆菌属菌株，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；编码基因的序列如SEQ ID NO.1所示。所述内切褐藻胶裂解酶最适反应温度20℃，稳定性高，常温贮藏6个月，酶活性保持80％以上，对于PolyG具有较高底物偏好性，产物主要聚合度4‑6，占反应产物的60％。本发明专利技术将该新褐藻胶裂解酶的基因克隆到大肠杆菌表达载体上，获得可异源表达该酶的大肠杆菌重组菌株，用该菌株异源表达制备的褐藻胶裂解酶AlgN15，可在低温或常温下对海藻粗资源实现高效降解。

【技术实现步骤摘要】
一种内切褐藻胶裂解酶、其编码基因及其制备方法和应用
本专利技术属于微生物基因工程领域，具体涉及一种黄杆菌属来源的内切褐藻胶裂解酶、其编码基因及其表达蛋白的制备方法和应用。
技术介绍
褐藻胶作为褐藻细胞壁的填充物质，是广泛存在于各种褐藻中的一类多糖物质，可占到藻体干重的20-40％。褐藻胶由α-L-古洛糖醛酸(α-L-guluronicacid，简称G)和β-D-甘露糖醛酸(β-D-mannuronicacid，简称M)两种单体单元组成，其中G和M互为C5位的差向异构体，它们随机排列成褐藻胶分子的三种结构区：聚甘露糖醛酸片段[polymannuronate，poly(M)]，聚古洛糖醛酸片段[polyguluronate，poly(G)]以及MG交替嵌段[heteropolymericM/Gblocks，poly(MG)]。褐藻胶溶于水，黏度高，可应用于食品、医药、纺织等领域。褐藻寡糖是褐藻胶的降解产物，分子量低，水溶性好，具有多种生物活性，如抗肿瘤、抗氧化、免疫调节、抑菌、促进作物生长等，在药物研制、功能食品及农用制剂研发等领域具有广阔的开发前景。研究发现褐藻寡糖的生物活性与其结构单元及聚合度密切相关，如Yamasaki等采用酸降解和酶降解两种方法制备的褐藻寡糖处理莱茵衣藻，发现酶法制备的褐藻寡糖以浓度依赖的方式显著促进莱茵衣藻生长，而酸水解制备的褐藻寡糖则没有表现出生物活性(JournalofBioscienceandBioengineering,113(1):112-116)。研究人员比较了不饱和甘露糖醛酸和古罗糖醛酸对胡萝卜和水稻的根伸长活性。聚甘露糖醛酸和聚古罗糖醛酸没有活性，但酶解聚古罗糖醛酸产物有较好活性，而且进一步分析聚合度与活性关系，发现五聚物具有最好的促生长活性(BioscienceBiotechnologyandBiochemistry,67(9):2022-2025)。最新在医药领域的研究表明：由寡M段褐藻胶寡糖制备的I类候选新药“GV971”能抑制β-淀粉样细胞的聚集和细胞毒性，可用于治疗轻中度阿尔兹海默症，已经获批上市。这表明，特定聚合度的大小及M/G的比例的褐藻胶寡糖具有重要应用价值和经济价值，因此实现这类寡糖的高效制备具有重要意义。目前褐藻胶寡糖的制备方法主要有化学降解法、物理降解法和酶降解法。其中化学降解法存在降解条件难以控制、产物质量不稳定的问题，物理降解法降解效率低，往往不能获得低聚合度的寡糖产品，相对而言，酶法降解具有降解条件温和，产物活性高等优点，而且由于酶法降解所具备的专一性特点，是实现特定聚合度的大小及M/G比例的褐藻胶寡糖生产的首选方法。高活性且专一性强的褐藻胶裂解酶是褐藻胶寡糖酶法制备的关键，褐藻胶裂解酶来源广泛，主要来源于海洋藻类、海洋软体动物，刺皮动物体内和多种微生物。目前，研究人员利用基因工程技术已成功将假单胞菌(Pseudomonassp.)、交替假单胞菌(Pseudoaltermonassp.)、弧菌(Vibriosp.)、克雷伯氏菌(Klebsiellasp.)、固氮菌(Azotobactersp.)、鞘氨醇单胞菌(Sphingomonassp.)、链霉菌(Streptomycessp.)等微生物的褐藻胶裂解酶基因克隆到大肠杆菌中，实现了目标酶蛋白的生产。然而上述酶蛋白大多还存在酶活不高，稳定性差等不足，尤其在特定结构单元和聚合度褐藻胶寡糖生产方面的报道还很少，专利201710458700.9公开了一种来源于海藻的高特异性褐藻胶裂解酶，产物为褐藻2糖或3糖。专利201810862414.3公开了三种来源于海洋嗜热菌DefluviitaleaPhaphyphilasp.Alg1的褐藻胶裂解酶AlgAT0,AlgAT1和AlgAT5，可分别应用于不饱和二糖、不饱和四糖以及不饱和一糖、二糖和单糖中的应用。专利201910671672.8公开了一种来源于需钠弧菌SK42.001的褐藻胶裂解酶，可特异性产生3糖。上述酶的发现为特定结构和聚合度的褐藻寡糖生产提供了有利的工具，然而上述酶所降解的寡糖片段聚合度相对较低，且最适反应温度通常在50度左右，在最适反应温度稳定性不高，半衰期仅有几个小时，在大规模的实际应用中还存在不足。海藻肥是一种天然高效的农用肥料，已广泛应用于粮食、水果和蔬菜作物上，具有增产、抗逆和环保等优势，海藻肥的生产可由海藻粗资源经褐藻胶降解酶降解获得，生产过程中高效获得功能物质决定了产品的品质优劣。酶降解法能较大程度的保留海藻中的核心功能物质，然而由于缺乏性能优良的酶制剂，目前我国该类产品的酶法生产工艺还尚未形成规模。
技术实现思路
为解决上述技术问题，本专利技术提供一种黄杆菌属来源的内切褐藻胶裂解酶、其编码基因及其表达蛋白的制备方法和应用。本专利技术第一方面提供了来源于黄杆菌菌株的内切褐藻胶裂解酶AlgN15，氨基酸序列如SEQIDNO.2所示；其氨基酸序列具有如下特征：(1)序列表中SEQIDNO.2从氨基端开始的第1-272位氨基酸残基序列；(2)对序列表中SEQIDNO.2所示的氨基酸序列进行一个或两个以上氨基酸取代、缺失或添加而形成的具有褐藻胶酶活性的氨基酸序列。本专利技术第二方面提供了从黄杆菌菌株中分离得到的内切褐藻胶裂解酶基因，其编码的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示，基因序列优选如SEQIDNO.1所示；所述基因序列可以是与SEQIDNO.1限定的脱氧核糖核酸(DNA)序列的同源性达到80％及以上，且能编码降解褐藻胶的蛋白质的脱氧核糖核酸(DNA)序列。本专利技术第三方面提供了制备内切褐藻胶裂解酶AlgN15的方法，所述方法将上述内切褐藻胶裂解酶基因克隆入重组表达载体，导入宿主细胞，获得重组表达的内切褐藻胶裂解酶。进一步地，重组表达内切褐藻胶裂解酶的表达载体，是大肠杆菌表达载体、酵母表达载体或枯草杆菌表达载体。进一步地，用于重组表达内切褐藻胶裂解酶的重组菌或转基因细胞系，是指大肠杆菌宿主细胞、酵母菌宿主细胞、枯草杆菌宿主细胞中的一种。本专利技术第四方面提供了内切褐藻胶裂解酶AlgN15在褐藻酸盐降解中的应用。同时提供了内切褐藻胶裂解酶AlgN15在海藻肥制备中的应用，可以在低温或常温条件下对海藻粗资源实现高效降解。本专利技术的有益效果：本专利技术所提供的内切褐藻胶裂解酶，最适反应温度为20℃，属于低温酶，具有非常高的稳定性，常温贮藏6个月，酶活性还可以保持80％以上，对于PolyG具有较高的底物偏好性，产物主要聚合度为4-6，可占反应产物的60％。可应用于褐藻酸盐降解，尤其可应用于高效海藻肥的制备，可以在低温或常温条件下实现对海藻粗资源完全高效降解利用，由于反应温度可低于室温，可极大程度的保持海藻中其它调节植物生长的核心功能物质的活性，具有广阔的应用前景，可广泛应用于化工、农业、食品、饲料添加、医药等领域。附图说明图1重组内切褐藻胶裂解酶Alg15N表达及纯化的聚丙烯酰胺凝胶电泳图(SDS-PAGE)；各泳道加入的样品分别是：泳道1：蛋白质标识物(mar本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种内切褐藻胶裂解酶AlgN15，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。/n

【技术特征摘要】
1.一种内切褐藻胶裂解酶AlgN15，其特征在于，其氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。


2.如权利要求1所述的内切褐藻胶裂解酶AlgN15，其特征在于，其氨基酸序列为对SEQIDNO.2所示的氨基酸序列进行一个或两个以上氨基酸取代、缺失或添加而形成的具有褐藻胶酶活性的氨基酸序列。


3.一种内切褐藻胶裂解酶基因，其特征在于，编码权利要求1所述的内切褐藻胶裂解酶。


4.如权利要求3所述的内切褐藻胶裂解酶基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。


5.一种制备内切褐藻胶裂解酶的方法，其特征在于，所述方法为：将权利要求3或4所述的内切褐藻胶裂解酶基因克隆入重组...

【专利技术属性】
技术研发人员：尹恒，王文霞，
申请(专利权)人：中国科学院大连化学物理研究所，
类型：发明
国别省市：辽宁;21