用于尿素循环蛋白和核酸的替代的细胞外囊泡制造技术

本发明专利技术涉及工程化的细胞外囊泡(EV)，其作为治疗尿素循环障碍的新颖的治疗方法。更具体地说，本发明专利技术涉及各种蛋白质工程化和核酸工程化策略用于改善尿素循环蛋白或编码尿素循环蛋白的核酸向EV中的装载以及将所得EV靶向感兴趣组织和器官的用途。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于尿素循环蛋白和核酸的替代的细胞外囊泡
本专利技术涉及工程化的细胞外囊泡(EV)，其作为治疗尿素循环障碍的新颖的治疗方法。更具体地说，本专利技术涉及各种蛋白质和核酸工程化策略用于改善尿素循环相关性蛋白质和/或核酸的装载以及将所得EV靶向感兴趣组织和器官的用途。
技术介绍
尿素循环中涉及的酶的基因缺陷导致含氮化合物尿素的新陈代谢不良。突变导致尿素循环中涉及的各种酶和转运体缺乏，并导致尿素循环障碍。如果任何尿素循环酶或转运体有缺陷的个体摄入的氨基酸超出了最低每日需求量，则所产生的氨将无法转化为尿素。这些个体可能会经历高氨血症或毒性循环中间体的累积。尿素循环障碍(UCD)是由与尿素生产有关的酶或线粒体转运蛋白不足引起的代谢遗传错误，其导致血液中氨的毒性水平积累(高氨血症)。最常见的尿素循环障碍是：·N-乙酰谷氨酸合酶缺乏症·氨基甲酰磷酸合成酶缺乏症·鸟氨酸氨甲酰基转移酶缺乏症·瓜氨酸血症(缺乏精氨酸琥珀酸合酶)·精氨酸琥珀酸尿症(缺乏精氨酸琥珀酸裂解酶)·精氨酸血症(缺乏精氨酸酶)·高鸟氨酸血症-高氨血症-同型瓜氨酸尿症(HHH)综合征(缺乏线粒体鸟氨酸转运体)·II型瓜氨酸血症(缺乏柠檬素，一种天冬氨酸谷氨酸转运体)·赖氨酸尿蛋白不耐受(y+L氨基酸转运体1发生突变)·乳清酸尿症(缺乏酶尿苷单磷酸合酶UMPS)UCD亚型包含由X连锁突变和鸟氨酸氨甲酰基转移酶(OTC)相应缺乏引起的亚型，以及由常染色体隐性突变和精氨酸琥珀酸合成酶(ASS)、氨基甲酰磷酸合成酶(CPS)、精氨酸琥珀酸裂解酶(ASL)、精氨酸酶(ARG)、N-乙酰谷氨酸合成酶(NAGS)、鸟氨酸转位酶(HHH)和天冬氨酸谷氨酸转运体(CITRIN)相应缺乏引起的亚型。这些是罕见疾病，在美国，据估计，每35,000例活产中的总体发病率大约为1例。当受试者经历氨水平>100μmol/L的高氨血症事件，并伴有与高氨血症相容的体征和症状，而没有其它明显原因时，则被怀疑为UCD，并且通常通过基因测试证实UCD。ASA以及其它UCD被认为是罕见的遗传性疾病。ASA的特征是缺乏或缺少精氨酸琥珀酸裂解酶(ASL)。ASL对两个代谢通路很重要：i)基于肝脏的尿素循环，该循环使氨解毒；以及ii)瓜氨酸一氧化氮循环，该循环由L-精氨酸合成一氧化氮。患有ASL缺乏症的患者可能在出生后不久或在生命后期发病，并以高氨血症和具有严重神经系统表型的多器官疾病为特征。这些患者目前的医疗需求尚未得到满足，因为ASA是第二大最常见的尿素循环障碍，目前仅提供对症治疗。UCD发病的严重性和时机根据缺乏的严重性而有所不同，取决于特定的酶或转运体的缺乏以及相关基因中的特定突变，严重性范围可以从轻到重。在发生如感染、创伤、手术、怀孕/分娩或饮食改变等突发事件之后，UCD患者可能在新生儿早期出现严重疾病，或者在儿童时期或甚至成人时期中的任何时间点发病。任何年龄的急性高氨血症发作都有患脑病的风险，并且所导致的神经系统损伤，有时甚至致命的，但甚至是慢性、亚临界的高氨血症也可能导致认知能力下降。因此，UCD与各个年龄段的神经系统异常以及智力和发育障碍的发生率显著相关。与生命后期发病的患者相比，患有新生儿发作疾病的UCD患者尤其容易经受认知障碍和死亡。目前还没有治愈尿素循环障碍的治疗法，因此，这代表了未满足的医疗需求。与尿素循环有关的障碍的治疗是旨在管理症状的终生过程。考虑对一些患者进行肝移植，但是主要的疾病管理策略是通过饮食限制来减少饮食中蛋白质的摄入。用除氨化合物进行药理治疗已广泛用于治疗UCD，但其不能治愈，仅能控制症状。苯丁酸钠或Buphenyl、苯甲酸钠、口服乳果糖和新斯波林(neosporin)可以帮助清除氨或防止结肠细菌产生氨，然而这些治疗方法通常伴有严重的副作用，并且治疗窗口相对较小。在许多情况下，还规定了多种维生素、钙和抗氧化剂的补充。药用级L-瓜氨酸补充剂用于氨基甲酰磷酸合成酶(CPS)和鸟氨酸氨甲酰基转移酶(OTC)缺乏症，而L-精氨酸用于精氨酸琥珀酸合酶缺乏症和瓜氨酸血症的情况下，以催化尿素循环中的酶并支持最佳的氨去除。抗酸剂通常用于减轻这些药物的胃肠道副作用，诸如反酸和胃痛。诸如蛋白质生物制剂之类的生物药物(其中UCD的一类重要但经常不足的药物是酶替代疗法(ERT))和RNA疗法可以提供治疗尿素循环障碍的更有效替代方法。然而，尽管ERT在治疗涉及溶酶体区室的酶缺乏症方面是活跃的，但对于UCD而言并不是可行的选择，因为ERT无法进入细胞内环境。mRNA存在一些相同的问题，即，进入细胞内空间受到质膜的严格限制。已显示，外泌体是各种类型的生物分子货物的优良载体，并被认为跨越血脑屏障，然而，外泌体在体内递送治疗性蛋白质和/或mRNA的实际用途并不简单，并且需要周密的囊泡工程化。基于核酸的疗法正在迅速地应用于临床。基因疗法、基于mRNA的疗法、基于短寡核苷酸和基于siRNA的疗法只是RNA疗法领域内众多模式中的一些实例。由于裸核酸(通常为RNA)由于快速清除、核酸酶活性、缺乏器官特异性分布以及细胞摄取效率低而难以在体内递送，因此通常必须使用专门的递送媒剂作为实现生物活性递送的手段。肝脏靶标和非肝脏靶标以及高分子量RNA疗法(诸如mRNA和基因疗法)都是这种情况。现有技术的EV装载技术通常在将蛋白质或核酸(NA)装载到EV中时效率非常低。首先，现有技术的装载系统导致EV与蛋白质和/或NA货物的可变装载，其次，被装载的那些EV每囊泡载有少量的蛋白质和/或NA拷贝(与这些问题相关的缺点将在下面更详细地讨论)。现有技术的装载技术通常依赖于将蛋白质治疗性货物或NA试剂外源装载到EV中。通常，蛋白质与EV分开生产，并通常通过电穿孔或转染将蛋白质装载到单独生产和纯化的EV中。这种方法具有许多缺点：(i)分别生产EV和治疗性货物的成本可能限制了商业化；(ii)外源装载技术可能会对EV本身的完整性和功能产生负面影响，(iii)纯化和下游加工可能很困难且需要多个步骤，而且劳动强度大；以及(iv)外源装载的复杂蛋白质可能会出现构象变化以及不稳定和/或错误的翻译后修饰问题，从而可能导致活性降低。类似地，现有技术的NA装载系统通常无法实现核酸货物的功能性、生物活性递送，这可能是由于：(i)mRNA和其它编码性RNA分子的装载效率低下且可变；(ii)通过现有技术递送的mRNA一旦到达细胞就不会被翻译，因为核酸不会从EV中释放出来；以及(iii)偶尔会使用产生次优EV的细胞来源。一种此类现有技术是在US14/502,494中描述的所谓的TAMEL系统。TAMEL系统存在所有上述缺点，并且还遭受以下事实的困扰：该系统依赖于噬菌体衍生的RNA结合蛋白，该RNA结合蛋白可能引起不期望的免疫反应性。因此，TAMEL系统不适合用于装载到EV中以及随后递送临床上相关数量的生物活性核酸，这主要是因为缺乏有效的装载和递送方式，部分原因是免疫毒性，由于EV的部分肝脾生物分布模式，这在肝病的情况本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于尿素循环蛋白的替代的细胞外囊泡(EV)，其特征在于，所述EV被工程化成包括至少一种尿素循环蛋白和/或至少一种编码尿素循环蛋白的多核苷酸。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20181116 GB 1818761.7;20190107 GB 1900197.31.一种用于尿素循环蛋白的替代的细胞外囊泡(EV)，其特征在于，所述EV被工程化成包括至少一种尿素循环蛋白和/或至少一种编码尿素循环蛋白的多核苷酸。


2.根据权利要求1所述的EV，其中所述尿素循环蛋白或编码尿素循环蛋白的所述多核苷酸编码选自包括以下各项的群组的蛋白质：精氨酸琥珀酸裂解酶(ASL)、精氨酸酶、线粒体鸟氨酸转运体、精氨酸琥珀酸合酶、N-乙酰谷氨酸合酶、氨基甲酰磷酸合成酶、鸟氨酸氨甲酰基转移酶、柠檬素、y+L氨基酸转运体1、尿苷单磷酸合酶或其任何片段、衍生物、结构域或其组合。


3.根据权利要求1或2所述的EV，其中所述尿素循环蛋白包括在融合多肽中，所述融合多肽包括EV富集多肽。


4.根据权利要求1或2所述的EV，其包括融合多肽，所述融合多肽包括EV富集多肽和核酸(NA)结合结构域。


5.根据权利要求4所述的EV，其中在所述融合多肽的所述NA结合结构域的辅助下，编码尿素循环蛋白的多核苷酸被转运到所述EV中。


6.根据权利要求5所述的EV，其中所述多核苷酸可以是mRNA、病毒基因组或编码至少一种尿素循环蛋白的质粒。


7.根据权利要求4到6中任一项所述的EV，其中所述NA结合结构域是以下一种或多种：来自PUF家族的蛋白质、来自Cas6家族的蛋白质、来自Cas13家族的蛋白质和/或核酸适体结合结构域或其任何片段、衍生物、结构域或其组合。


8.根据权利要求3到7中任一项所述的EV，其中所述EV富集多肽选自包括以下各项的群组：CD9、CD53、CD63、CD81、CD54、CD50、FLOT1、FLOT2、CD49d、CD71、CD133、CD138、CD235a、ALIX、AARDC1、棕榈酰化信号(Palm)、同线蛋白(Syntenin)-1、同线蛋白-2、Lamp2b、TSPAN8、多配体蛋白聚糖(syndecan)-1、多配体蛋白聚糖-2、多配体蛋白聚糖-3、多配体蛋白聚糖-4、TSPAN14、CD3...

【专利技术属性】
技术研发人员：J·希恩，H·阿明，V·卡斯蒂拉洛伦特，
申请(专利权)人：医福斯治疗有限公司，
类型：发明
国别省市：英国;GB