用于亲和纯化的工程细胞外囊泡制造技术

本发明专利技术涉及装载有药物的细胞外囊泡(特别是外泌体)的基于亲和力的分离和纯化，其中外泌体被工程化以能够实现亲和纯化。泌体被工程化以能够实现亲和纯化。泌体被工程化以能够实现亲和纯化。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于亲和纯化的工程细胞外囊泡


[0001]本专利技术涉及装载有药物的细胞外囊泡(EV)(特别是外泌体)的基于亲和力的分离和纯化，其中EV被工程化以能够实现亲和纯化。

技术介绍

[0002]细胞外囊泡(EV)是由产生EV的细胞释放到细胞外环境中的纳米大小的囊泡(流体动力学直径通常小于1000nm)。EV并且特别是外泌体(其通常由不同的参数定义，例如在其膜上各种四跨膜蛋白的存在或其大小)已经被证明能够将蛋白质生物(诸如抗体和siRNA)转运到靶细胞中，使得能够实现利用EV的特性与重组蛋白的特异性相结合的全新形式的先进生物疗法。
[0003]制备和分离EV(例如外泌体)的常规的小规模方法涉及一系列差速离心步骤，以将囊泡与EV释放到其中的培养基中存在的细胞或细胞碎片分离。典型地，施加以例如3,000g、10,000g和70,000g或100,000g的一系列离心，在离心后，将管的底部的所得沉淀用盐水溶液重悬至其原始体积的一部分，以构成浓缩的EV或外泌体溶液。然而，由于多种原因，这些方法基本上不适合于临床应用：(1)整个过程所需的延长的时间长度，(2)关于规模扩大、在GMP环境中的可操作性以及与该GMP环境的依从性的问题，(3)被细胞碎片污染的重大风险，(4)由于操作者的可变性导致的差的再现性，(5)由于囊泡的沉淀导致的EV/外泌体的聚集，(6)在加工结束时的低回收率，以及(7)对囊泡形态以及由此对潜在地生物分布和活性的负面影响。因此，需要纯化EV的改进的方法，并且允许生产治疗质量的囊泡制剂。为此，PCT申请WO2000/044389公开了用于通过色谱技术(诸如阴离子交换色谱和/或凝胶渗透色谱)从生物样品制备膜囊泡的方法。WO2014/168548公开了一种用于EV的显著改进的分离和纯化方法，即，使用过滤和各种形式的液相色谱的顺序组合，例如超滤和尺寸排阻液相色谱的组合。然而，这些技术主要是利用EV的物理化学特性，例如它们的大小和电荷，而不管被工程化到EV中或上的特定部分或结构域的存在和/或EV中药物货物的存在。因此，在本领域中非常需要用于纯化EV的改进的、特定的和以药物为中心的方法，用于例如治疗应用，特别是用于装载有特定药物货物的EV的纯化和富集。

技术实现思路

[0004]因此，本专利技术的一个目的是克服与EV(并且特别是来自装载有各种类型的药物货物的EV群体的EV)的分离和纯化相关的上述问题。此外，本专利技术旨在满足本领域内的其他现有需要，例如开发用于以高产率和高特异性进行EV纯化的普遍适用的亲和纯化策略。
[0005]本专利技术通过本专利技术的蛋白质工程实现了这些和其他目的，该蛋白质工程使得能够使用单个融合蛋白构建体将药物加载到EV中和对这样的EV进行基于亲和力的纯化。在第一方面中，本专利技术涉及这样的本专利技术的融合蛋白，其包含至少以下组分：(i)EV多肽(也可互换地被称为外泌体多肽、EV蛋白、外泌体蛋白和类似术语)、(ii)纯化部分和(iii)载药部分。在第二方面中，本专利技术涉及融合蛋白与感兴趣的药物(DOI)之间的复合物。融合蛋白与DOI
之间的相互作用通常基于融合蛋白的载药部分与DOI的位点、区域、结构域或结构或化学特征之间的非共价相互作用。
[0006]在高度创造性的方面中，本专利技术涉及包含本专利技术的融合蛋白的细胞外囊泡(EV)。此外，如上所述，融合蛋白能够借助于其载药部分与DOI相互作用，并且因此EV可以进一步包含DOI，其可以与融合蛋白以复合物的形式存在，但其也可以已经从融合蛋白释放或解离，并且作为游离的DOI存在于EV中。根据本专利技术，优选的DOI包括基于蛋白质、肽和/或核酸(NA)的试剂，例如各种形式的RNA治疗剂，诸如mRNA、miRNA、短发夹RNA、引导RNA、单引导RNA或其组合，例如Cas-CRISPR核糖核蛋白。本专利技术的EV优选地为外泌体或微囊泡，或者可从内溶酶体途径或质膜获得的任何其他类型的EV。
[0007]在进一步的方面中，本专利技术涉及编码本文的融合蛋白的多核苷酸，以及包含这样的多核苷酸的载体和细胞。本专利技术的细胞可以进一步包含所述融合蛋白以及编码DOI的多核苷酸。
[0008]在进一步的重要方面中，本专利技术涉及用于产生包含根据本专利技术的融合蛋白的EV的方法。这些方法通常包含以下步骤：提供包含根据本专利技术的融合蛋白的EV的群体，并且将这样的群体暴露于亲和纯化系统，例如允许包含在EV中的纯化结构域与固相上的配体结合的色谱系统，允许捕获包含融合蛋白和通常为DOI的EV。更具体地，这样的方法通常包含以下步骤：(i)将编码所讨论的融合蛋白的多核苷酸引入到产生EV的细胞中，以及(ii)允许产生EV的细胞产生包含该融合蛋白的EV。此外，可以将编码感兴趣的药物(DOI)的多核苷酸引入到产生EV的细胞中，以便允许产生EV的细胞产生包含融合蛋白的EV，其中融合蛋白的载药部分与DOI结合并将其转运到EV中，从而产生包含融合蛋白和DOI两者的EV，通常最初作为复合物的一部分，但作为DOI从融合蛋白中释放的结果，作为单一实体。编码DOI的多核苷酸可以编码各种类型的药物货物，包括蛋白质、肽、mRNA、短发夹RNA、miRNA、pri-miRNA、pre-miRNA、反义寡核苷酸、引导RNA、单引导RNA、环状RNA、piRNA、tRNA、rRNA、snRNA、IncRNA、核酶、DNA和/或其任何组合或衍生物。化学修饰的寡核苷酸货物是特别优选的。
[0009]在又一个方面中，本专利技术涉及一种纯化包含DOI的EV的方法。该方法通常包含以下步骤：(i)提供根据本专利技术的EV，(ii)允许包含在EV中的融合蛋白的纯化部分结合纯化配体；以及(iii)去除未与纯化配体结合的EV。
[0010]在进一步的方面中，本专利技术涉及一种包含EV和药学上可接受的载体的药物组合物，以及使用该药物组合物或EV(和EV的群体)的医学用途和医学治疗。
附图说明
[0011]图1示出了包含融合蛋白的EV(诸如外泌体)的示意图，该融合蛋白包含载药部分、外泌体蛋白和纯化结构域。此外，EV包含药物货物分子，在这种情况下，作为非限制性示例，是发夹RNA形式的RNA货物分子，其被载药部分结合并穿梭到EV中，该EV随后使用融合蛋白的纯化结构域进行纯化。
[0012]图2比较了来自使用两种不同纯化工艺纯化的EV批次的产量。EV被基因工程化为包含融合蛋白，该融合蛋白包含作为外泌体蛋白的CD63、作为纯化结构域的ZZ结构域和作为用于mRNA药物加载的载药部分的Cas6。借助于Cas6 mRNA负载结构域，将纳米荧光素酶mRNA装载到外泌体中，并且使用生物发光读数来评估在外泌体介导的递送后翻译的总
mRNA。如在图2中可以看到的，TFF和珠洗脱尺寸排阻色谱法(BE-SEC纯化)的组合得到约5E8的RLU，而基于IgG柱的亲和色谱过程导致约3.2E9的RLU，这是由于最终EV群体中纳米荧光素酶mRNA的较高的富集。
[0013]图3示出了包含融合蛋白的EV的示意图，该融合蛋白包含载药部分、外泌体蛋白、纯化结构域，以及插入在纯化结本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种融合蛋白，包含(i)EV多肽、(ii)纯化结构域和(iii)载药部分。2.根据权利要求1所述的融合蛋白，其中所述载药部分是核酸(NA)结合蛋白或蛋白结合结构域。3.根据前述权利要求中任一项所述的融合蛋白，其中所述EV多肽选自包含以下的群组：CD9、CD53、CD63、CD81、CD82、CD54、CD50、FLOT1、FLOT2、CD49d、CD71、CD133、CD138、CD235a、ALIX、Syntenin-1、Syntenin-2、Lamp2b、TSPAN8、syndecan-1、syndecan-2、syndecan-3、syndecan-4、TSPAN14、CD37、CD82、CD151、CD231、CD102、NOTCH1、NOTCH2、NOTCH3、NOTCH4、DLL1、DLL4、JAG1、JAG2、CD49d/ITGA4、ITGB5、ITGB6、ITGB7、CD11a、CD11b、CD11c、CD18/ITGB2、CD41、CD49b、CD49c、CD49e、CD51、CD61、CD104、Fc受体、白介素受体、免疫球蛋白、MHC-I或MHC-II组分、CD2、CD3ε、CD3ζ、CD13、CD18、CD19、CD30、CD34、CD36、CD40、CD40L、CD44、CD45、CD45RA、CD47、CD86、CD110、CD111、CD115、CD117、CD125、CD135、CD184、CD200、CD279、CD273、CD274、CD362、COL6A1、AGRN、EGFR、GAPDH、GLUR2、GLUR3、HLA-DM、HSPG2、L1CAM、LAMB1、LAMC1、ARRDC1、LFA-1、LGALS3BP、Mac-1α、Mac-1β、MFGE8、SLIT2、STX3、TCRA、TCRB、TCRD、TCRG、VTI1A、VTI1B以及任何其他EV多肽，以及其任何组合、衍生物、结构域、突变的变体和/或区域。4.根据前述权利要求中任一项所述的融合蛋白，其中所述EV多肽是跨膜或膜相关多肽。5.根据权利要求4所述的融合蛋白，其中所述跨膜或膜相关EV多肽选自包含以下的群组：CD63、CD81、CD9、CD82、CD44、CD47、CD55、LAMP2B、ICAM、整联蛋白以及任何其他EV多肽，以及其任何组合、衍生物、结构域、突变的变体或区域。6.根据权利要求1至5中任一项所述的融合蛋白，其中所述EV多肽是融合到将所述融合蛋白定位于所述外泌体膜的跨膜或膜相关多肽的非跨膜多肽。7.根据权利要求7所述的融合蛋白，其中所述非跨膜EV多肽融合到将所述融合蛋白定位于所述外泌体膜的跨膜多肽。8.根据前述权利要求中任一项所述的融合蛋白，其中所述NA结合蛋白选自包含以下的群组：mRNA结合蛋白、miRNA结合蛋白、pre-rRNA结合蛋白、tRNA结合蛋白、小核或核仁RNA结合蛋白、非编码RNA结合蛋白、转录因子、核酸酶、RISC蛋白，以及其任何组合、衍生物、结构域或部分。9.根据前述权利要求中任一项所述的融合蛋白，其中所述NA结合蛋白是以下中的任何一个：PUF、PUF531、PUFx2、DDX3X、EEF2、EEF1A1、HNRNPK、HNRNPM、HNRNPA2B1、HNRNHPH1、HNRNPD、HNRNPU、HNRNPUL1、NSUN2、Cas6、Cas13、Cas9、WDR1、HSPA8、HSP90AB1、MVP、PCB1、MOCS3、DARS、ELC2、EPRS、GNB2L1、IARS、NCL、RARS、RPL12、RPS18、RPS3、RUVBL1、TUFM、hnRNPA1、hnRNPA2B1、DDX4、ADAD1、DAZL、ELAVL4、ELAVL1、IGF2BP3、HNRNPQ、RBFOX1、RBFOX2、U1A、PPR家族、ZRANB2、NUSA、IGF2BP1、IGF2BP2、Lin28、KSRP、SAMD4A、TDP43、FUS、FMR1、FXR1、FXR2、EIF4A1-3、MS2外壳蛋白、DEAD、KH、GTP_EFTU、dsrm、G-patch、IBN_N、SAP、TUDOR、RnaseA、MMR-HSR1、KOW、RnaseT、MIF4G、zf-RanBP、NTF2、PAZ、RBM1CTR、PAM2、Xpo1、Piwi、CSD，以及其任何组合、衍生物、结构域、区域、位点、突变的变体或部分。10.根据前述权利要求中任一项所述的融合蛋白，其中所述纯化结构域是受体、抗体结合多肽、Fc结合多肽、多组氨酸、谷胱甘肽S-转移酶(GST)、麦芽糖结合蛋白(MBP)、钙调蛋白
结合肽(CBP)、蛋白内含子-几丁质结合结构域(I-CBD)、链霉抗生物素蛋白、抗生物素蛋白、FLAG表位标签、HA表位标签、T7标签、S-标签、CLIP、DHFR、纤维素结合结构域，以及其任何组合、衍生物、结构域或部分。11.根据权利要求10所述的融合蛋白，其中所述Fc结合多肽选自包含以下的群组：蛋白A、蛋...

【专利技术属性】
技术研发人员：V，
申请(专利权)人：医福斯治疗有限公司，
类型：发明
国别省市：