具有改善的半衰期的细胞外囊泡制造技术

本发明专利技术涉及细胞外囊泡(EV)，其中EV包括存在于EV的表面上的结构域，其改变此类EV的循环时间。此类EV展示改善的药代动力学，因此可用作治疗剂。此类EV也可用于EV原料药的亲和纯化。化。化。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】具有改善的半衰期的细胞外囊泡


[0001]本专利技术涉及具有改善的药代动力学概况、增加的半衰期和增加的体内肿瘤积累以及在储存时增加的稳定性的遗传工程改造的细胞外囊泡(EV)。本专利技术还涉及所述EV在疗法中的用途、生产所述EV的方法和所述EV的纯化。

技术介绍

[0002]EV(如外泌体)通常为纳米大小的囊泡，其由大多数细胞类型内源性产生，并且用作细胞之间蛋白质、核酸、肽、脂质和各种其他分子的身体的天然运输系统。EV具有许多潜在的治疗用途，并且EV已经被研究作为蛋白质、核酸和小分子治疗剂的递送载体。然而，EV用于治疗疾病的有前景的潜在临床应用目前受到EV在特别是静脉内施用后的快速清除的影响。由于短的半衰期，大多数非靶向的EV回到肝脏和脾脏，这意味着非靶向的EV疗法的治疗应用主要集中在这些靶器官上。
[0003]EV在体内的短循环时间是开发其可观的治疗潜力的主要限制之一。此外，已知EV主要由肝脏和脾脏摄取。这种独特的生物分布模式意味着靶向除了肝脾系统以外的器官需要大剂量和/或包含特异性靶向部分以将EV导向其他靶器官，这是本专利技术试图克服的问题。期望将EV从通过肝脏和脾脏的摄取中转移出来，使得这将增加向其他器官的递送，并且因此改善生物分布(尤其是靶向的EV，例如向大脑的递送)。
[0004]存在许多常用技术以增加药物和生物制品的半衰期。通常，使用延长半衰期的四种一般策略之一：
[0005]1)药理学活性肽或蛋白质与天然长半衰期蛋白质或蛋白质结构域的非共价结合或遗传融合，例如Fc融合、转铁蛋白或白蛋白融合，或与惰性多肽(例如，XTEN、同
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氨基酸聚合物、脯氨酸
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丙氨酸
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丝氨酸聚合物或弹性蛋白样肽)的融合。
[0006]2)通过药理学活性肽或蛋白质与重复化学部分(例如，与聚乙二醇(PEG)(聚乙二醇化)或透明质酸)的化学缀合，增加流体动力学半径。
[0007]3)通过多唾液酸化(polysialylation)显著增加药理学活性肽或蛋白质的负电荷；或者，可替代地，融合带负电荷的、高度唾液酸化的肽(例如，羧基末端肽[CTP；绒毛膜促性腺激素(CG)β
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链的])，已知延长如人CGβ
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亚基的天然蛋白质对生物药物候选物的半衰期。
[0008]4)用不同长度和结构的PEG包被或缀合药剂(例如，脂质或聚合物纳米颗粒或治疗性蛋白质)，以便降低货物分子的静电荷并保护其免受免疫系统细胞、肾脏或肝脏清除机制的影响。
[0009]除了聚乙二醇化，所有这些目前的方法仅已在临床上成功地用于重组蛋白或在一些情况下用于RNA治疗剂，但从未用于纳米颗粒形式的大分子组件，如EV，其受到体内完全不同的生物物理和免疫学考虑因素的影响。特别是，EV除了比单一蛋白质或RNA治疗剂大得多之外，还携带非常不同的电荷，这使得将改变药代动力学/药效学的现有方法转化为EV的情况非常不可预测。
[0010]然而，上述现有方法具有一些明显的缺点。对Fc融合的主要关注是稳定性、接头和融合蛋白中的异常糖基化，而对HSA融合的主要关注是生物分布可能更局限于特定器官。Fc蛋白的融合也很庞大，并且会导致融合蛋白干扰治疗剂的活性的问题。
[0011]过去曾尝试过EV的聚乙二醇化，但收效甚微。首先，在不干扰EV拓扑和表型的情况下，将PEG与EV缀合是有挑战的。其次，PEG是人工物质，其当被注射时可能会产生毒副作用。此外，它还具有免疫原性，这也可能导致毒性以及药物产品从循环中的清除。
[0012]在EV的情况下使用唾液酸化来增加它们的半衰期是不太可能起作用的，因为存在识别驱动某些EV亚类的摄取的唾液酸化部分的受体。例如，B细胞外泌体被脾脏中的唾液酸粘附素摄取。此外，增加EV上的糖基化模式并不像对于更简单的蛋白质治疗剂那样容易，因为EV已经包括覆盖EV的膜(类似于质膜)；因此它们在它们的表面上已经具有糖基化的蛋白质。已知EV上常见的蛋白质被高度糖基化，因此带负电荷。因此，增加EV表面的唾液酸化可能没有益处。

技术实现思路

[0013]因此，本专利技术的目的是克服上述与EV的半衰期和生物分布相关的问题。
[0014]在第一方面，本专利技术涉及被修饰以包括至少一个存在于EV的表面上的白蛋白结合结构域(ABD)的EV。ABD可以与EV蛋白形成融合蛋白的一部分，任选地，其中EV蛋白是跨膜EV蛋白或与EV膜的外表面缔合的EV蛋白。
[0015]在第二方面，本专利技术涉及根据第一方面的用于产生EV的方法，其包括：(i)将至少一种编码ABD
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EV蛋白融合构建体的多核苷酸构建体引入到产生EV的细胞中；和(ii)在产生EV的细胞中表达所述构建体，从而产生包括存在于EV的表面上的ABD的EV。
[0016]在第三方面，本专利技术涉及一种药物组合物，其包括至少一种第一方面的EV和药学上可接受的赋形剂或载剂。
[0017]在第四方面，本专利技术涉及用于药物的第一方面的EV和/或第三方面的药物组合物。
附图说明
[0018]图1：显示融合构建体在稳定细胞中的良好表达的蛋白质印迹。
[0019]图2：显示融合构建体在EV中的良好表达的蛋白质印迹。
[0020]图3：体内半衰期延长，其显示ABD的存在显著增加了循环中EV的半衰期，并且通过使它们更稳定，导致与对照EV相比循环中的EV多14倍以上。
[0021]图4：ABD EV的体内生物分布，其显示与对照EV相比靶器官中的EV的显著的倍数增加。
[0022]图5：ABD EV的体内生物分布，其显示与对照EV相比ABD EV的肿瘤积累。
[0023]图6：ABD EV的体内生物分布，其显示与对照EV相比ABD EV的淋巴结积累。
[0024]图7：ABD
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EV白蛋白体外结合测定，其显示与对照EV相比，ABD EV能够结合白蛋白。
[0025]图8：与对照EV相比，ABD EV结合白蛋白的能力的流式细胞术分析。
[0026]图9：另外的ABD
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EV白蛋白体外结合测定，其测试一系列额外的构建体。
[0027]图10：另外的体内半衰期延长实验测定，其测试一系列额外的构建体。
[0028]图11：体外白蛋白结合数据与体内血浆半衰期延长数据相结合，用于表达与单程
跨膜EV蛋白融合的ABD的EV。
[0029]图12：ABD EV体内生物分布，其显示与对照EV相比ABD EV的淋巴结和肿瘤积累。
[0030]图13：显示通过不同施用途径递送后ABD EV在血浆中的半衰期的图。
[0031]图14：显示来源于替代细胞来源的ABD EV的改善的血浆半衰期的图。
[0032]图15：梯度分离(斑点印迹定量)和宽视野显微镜图像，其显示白蛋白和表达ABD的EV的共定位。
[0033]图16：显示以定量的斑点印迹表示的体内ABD结合测定的图本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种细胞外囊泡(EV)，所述细胞外囊泡被修饰以包括至少一个存在于所述EV的表面上的白蛋白结合结构域(ABD)。2.根据权利要求1所述的EV，其中所述ABD与EV蛋白形成融合蛋白的一部分，任选地，其中所述EV蛋白是跨膜EV蛋白或与所述EV膜的外表面缔合的EV蛋白。3.根据权利要求2所述的EV，其中所述ABD被工程改造到多程跨膜蛋白的囊泡外环中，任选地，其中所述多程跨膜蛋白是四次跨膜蛋白。4.根据权利要求2或3所述的EV，其中所述EV蛋白选自由以下组成的组：CD63、CD81、CD9、CD82、CD44、CD47、CD55、LAMP2B、ICAM和ARRDC1，以及其衍生物、结构域、变体、突变体或区域。5.根据前述权利要求中任一项所述的EV，其中所述EV包括多于一个ABD。6.根据权利要求2至5中任一项所述的EV，其中在同一融合蛋白中存在多于一个ABD。7.根据前述权利要求中任一项所述的EV，其中所述EV进一步装载有治疗性货物，任选地，其中所述治疗性货物为蛋白质、核酸、病毒、病毒基因组、抗原或小分子。8.根据权利要求7所述的EV，其中所述治疗性货物选自由以下组成的组：核酸，任选地RNA分子、DNA分子或混合物、mRNA、反义或剪接转换寡核苷酸、siRNA、shRNA、miRNA、质粒DNA(pDNA)、超螺旋或非超螺旋的质粒或小圆圈；肽或蛋白质，任选地转运蛋白、酶、受体(任选地诱饵受体)、...

【专利技术属性】
技术研发人员：X，
申请(专利权)人：医福斯治疗有限公司，
类型：发明
国别省市：