一种L-苏氨酸醛缩酶突变体、基因及应用制造技术

本发明专利技术公开了一种L‑苏氨酸醛缩酶突变体、基因及应用。所述L‑苏氨酸醛缩酶突变体由野生型L‑苏氨酸醛缩酶突变所得，能够以甘氨酸和对甲砜基苯甲醛为底物，以磷酸吡哆醛为辅酶，催化缩合反应生成L‑syn‑对甲砜基苯丝氨酸。使用本发明专利技术L‑苏氨酸醛缩酶突变体生产L‑syn‑对甲砜基苯丝氨酸具有以下优点：1、生产工艺简单，反应条件温和；2、L‑苏氨酸醛缩酶的选择性高，产品光学纯度高，无需拆分；3、原子利用率高，理论可达100％；4、生产过程环保，污染较小，符合绿色化学理念；5、产品分离纯化简单。

【技术实现步骤摘要】
一种L-苏氨酸醛缩酶突变体、基因及应用本申请是“一种L-苏氨酸醛缩酶突变体、基因及制备L-syn-对甲砜基苯丝氨酸的方法”的分案申请，原申请的申请日为2020年1月17日，申请号为2020100508531。
本专利技术涉及酶工程
，特别是涉及一种L-苏氨酸醛缩酶突变体、基因及制备L-syn-对甲砜基苯丝氨酸的方法。
技术介绍
L-syn-对甲砜基苯丝氨酸是一种重要的医药中间体，应用于多种抗生素的合成。对甲砜基苯丝氨酸有两个手性中心，具有四种异构体，分别是：L-syn-对甲砜基苯丝氨酸，L-anti-对甲砜基苯丝氨酸，D-syn-对甲砜基苯丝氨酸，D-anti-对甲砜基苯丝氨酸(图1)。目前，L-syn-对甲砜基苯丝氨酸主要有两种生产方法。一种是化学法合成，使用硫酸铜为催化剂，利用金属离子的络合作用，对甲砜基苯甲醛和甘氨酸选择性反应生成两种顺式的产物：L-syn-对甲砜基苯丝氨酸铜和D-syn-对甲砜基苯丝氨酸铜，酸不能直接进行拆分，只能继续和乙醇进行酯化反应，生成外消旋的D,L-syn-对甲砜基苯丝氨酸乙酯，再进行手性拆分，实现D型和L型异构体的分离，从而制得光学纯的L-syn-对甲砜基苯丝氨酸乙酯。此工艺主要存在以下缺点：理论收率只有50％、无效对映体难套用、工艺比较复杂。同时需要使用等摩尔量手性拆分试剂、单次拆分收率低、拆分试剂的回用和反应中的铜盐会产生大量的废水和废盐。另一种是将化学法和生物法结合，主要过程是先利用对甲砜基苯甲醛和甘氨酸在硫酸铜的催化作用下生成消旋的对甲砜基苯丝氨酸铜盐，主要产物是L-syn-对甲砜基苯丝氨酸铜和D-syn-对甲砜基苯丝氨酸铜(图2)。除去产品中的铜离子生成L-syn-对甲砜基苯丝氨酸和D-syn-对甲砜基苯丝氨酸混合物。再使用D-苏氨酸醛缩酶分解D-syn-对甲砜基苯丝氨酸达到拆分的目的，得到光学纯的L-syn-对甲砜基苯丝氨酸。此工艺存在以下缺点：生产工艺复杂，原子利用率不高，理论收率只能达到50％、同样也会产生铜盐环境污染问题。相比之下，使用L-苏氨酸醛缩酶突变体催化对甲砜基苯甲醛和甘氨酸直接生成L-syn-对甲砜基苯丝氨酸(图3)，具有以下优点：1、生产工艺简单，反应条件温和；2、L-苏氨酸醛缩酶的选择性高，产品光学纯度高；3、无需拆分，原子利用率高，理论可达100％；4、生产过程环保，污染较小，符合绿色化学理念；5、下游分离纯化工艺简单。利用L-苏氨酸醛缩酶催化合成L-syn-对甲砜基苯丝氨酸的关键在于获得能够高选择性合成L-syn-对甲砜基苯丝氨酸的酶。目前报道的L-苏氨酸醛缩酶对α-碳具有较高的选择性，ee(％)>99％。而对β-碳的选择性不高，de(％)在20-50％之间，产生L-syn-对甲砜基苯丝氨酸和L-anti-对甲砜基苯丝氨酸的混合物。因此目前没有直接应用L-苏氨酸醛缩酶合成高手性纯度L-syn-对甲砜基苯丝氨酸的研究报道。
技术实现思路
本专利技术针对现有L-syn-对甲砜基苯丝氨酸合成工艺存在的缺陷，提供了一种利用L-苏氨酸醛缩酶突变体制备L-syn-对甲砜基苯丝氨酸的方法，该方法原料利用率高，且可循环利用。产物易于分离提纯且转化率、收率及手性纯度高；与化学催化工艺相比，工艺简单，污染小。一种L-苏氨酸醛缩酶突变体，由登录号分别为WP_015261381.1、SIS82838.1、WP_016204489.1、WP_023973138.1、WP_077361571.1或WP_069998496.1的野生型L-苏氨酸醛缩酶突变所得，具体为以下突变中的一种：(1)由登录号为WP_015261381.1的野生型L-苏氨酸醛缩酶突变所得，突变位点为以下一种：5F、5W、8H、8F、31H、31M、125K、125V、143K、143R、227R、252F、252H、305R、305K、307H、307R、308H、308K、5F/8H/31H/125V、5F/8H/31H/305R、31H/125V/227R/305R、5F/8H/31H/125V、5F/125V/227R/E305R、8H/31H/125V/227R、8H/31H/143R/305R、5F/8H/31H/125V/227R/E305K、5F/8H/Y31M/125V/227R/305R、5W/8H/31H/125V/227R/305R、5F/8F/31H/125K/227R/E305R、8H/31H/125V/143R/252F/305R、5F/8H/31H/125V/143K/305R/307R、8F/31H/125V/143R/227R/305R/307H、8F/31H/125V/143R/252F/305R/308H、8F/31M/125V/143R/252F/305R/308K；(2)由登录号为SIS82838.1的野生型L-苏氨酸醛缩酶突变所得，突变位点为以下一种：18F、18W、21H、21F、44H、44M、138K、138V、157K、157R、241R、241F、266H、319R、319K、321H、321R、322H、322K、18F/21H/44H/138V、18F/21H/44/319R、44H/138V/241R/319R、18F/21H/44H/138V、18F/138V/241R/319R、21H/44H/138V/241R、21H/44H/157R/319R、13F/21H/44H/138V/241R/319K、13F/21H/44M/138V/241R/319R、13W/21H/44H/138V/241R/319R、13F/21F/44H/138K/241R/319R、21H/31H/138V/157R/266F/319R、13F/21H/44H/138V/143K/319R/322R、21F/44H/138V/157R/241R/319/322H、21F/44H/138V/157R/266F/319/323H、21F/44M/138V/157R/266F/319R/323K；(3)由登录号为WP_016204489.1的野生型L-苏氨酸醛缩酶突变所得，突变位点为以下一种：5F、5W、8H、8F、31H、31M、125K、125V、143K、143R、227R、252F、252H、305R、305K、307H、307R、308H、308K、5F/8H/31H/125V、5F/8H/31H/305R、31H/125V/227R/305R、5F/8H/31H/125V、5F/125V/227R/E305R、8H/31H/125V/227R、8H/31H/143R/305R、5F/8H/31H/125V/227R/E305K、5F/8H/Y31M/125V/227R/305R、5W/8H/31H/125V/227R/305R、5F/8F/31H/125K/227R/E305R、8H/31H/125V/143R/252F/305R、5F/8H/31H/125V/14本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种L-苏氨酸醛缩酶突变体，其特征在于，由登录号WP_069998496.1的野生型L-苏氨酸醛缩酶突变所得，具体为以下突变中的一种：/n5F/8H/31H/305R；31H/125V/227R/305R；5F/8H/31H/125V/227R/E305K；5F/8F/31H/125K/227R/E305R；8F/31H/125V/143R/227R/305R/307H；8F/31M/125V/143R/252F/305R/308K。/n

【技术特征摘要】
1.一种L-苏氨酸醛缩酶突变体，其特征在于，由登录号WP_069998496.1的野生型L-苏氨酸醛缩酶突变所得，具体为以下突变中的一种：
5F/8H/31H/305R；31H/125V/227R/305R；5F/8H/31H/125V/227R/E305K；5F/8F/31H/125K/227R/E305R；8F/31H/125V/143R/227R/305R/307H；8F/31M/125V/143R/252F/305R/308K。


2.编码如权利要求1所述L-苏氨酸醛缩酶突变体的基因。


3.包含如权利要求2所述基因的表达载体。


4.如权利要求3所述的表达载体，其特征在于，为插入有如权利要求2所述基因的pET28a质粒。

【专利技术属性】
技术研发人员：吴坚平，郑文隆，陈开通，徐刚，杨立荣，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：浙江;33