一种内切型褐藻胶裂解酶及其编码基因和应用制造技术

本发明专利技术公开了一种内切型褐藻胶裂解酶及其编码基因和应用。所述内切型褐藻胶裂解酶TsAly7C的氨基酸序列如SEQ ID No.7所示，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。所述内切型褐藻胶裂解酶TsAly7C的降解方式为内切型，能够显著降解褐藻胶、polyM和polyG，进而获得饱和褐藻胶单糖、不饱和褐藻胶单糖和不饱和褐藻胶二糖，除此之外，该酶属于一种冷适应的褐藻胶裂解酶，适合反应温度为20‑30℃，具有NaCl依赖性。本发明专利技术还构建了包含所述内切型褐藻胶裂解酶TsAly7C编码基因的重组载体和重组菌株，能够为工业化应用和生产生物乙醇提供良好的工具。

【技术实现步骤摘要】
一种内切型褐藻胶裂解酶及其编码基因和应用
本专利技术属于生物工程
，具体涉及一种内切型褐藻胶裂解酶及其编码基因和应用。
技术介绍
生物乙醇作为石油衍生燃料的替代品已经引起了人们的注意。木质纤维素生物质中木质素的存在使生物转化过程中碳水化合物的提取复杂化，导致生物乙醇生产效率低下。因此，利用低木质素含量的原料是低成本生产生物乙醇的有效途径。褐藻因其木质素含量低而成为良好的生物乙醇生产来源。而且藻类种类丰富，生长速度快，无需耕地，也显著降低了生物乙醇的生产成本。褐藻胶是褐藻细胞壁的主要多糖，占褐藻干重的40%。褐藻胶是一种由β-D-甘露糖醛酸(β-D-mannuronicacid,M)及其C5差向异构体α-L-古罗糖醛酸(α-L-guluronicacid,G)组成的大分子共聚物。褐藻胶有三种不同的聚合形式：polyG、polyM和polyMG，它们由G单元、M单元或G和M随机交替聚合组成。褐藻胶裂解酶是一种多糖裂解酶，通过β-消除反应降解褐藻胶的1→4糖苷键。根据作用方式的不同，褐藻胶裂解酶分为内切型和外切型。内切型褐藻胶裂解酶裂解褐藻胶聚合物内的糖苷键，释放不饱和低聚糖（二糖、三糖和四糖）作为主要产物，外切型褐藻胶裂解酶从末端依次切割糖链，生成单糖。褐藻胶降解产生的不饱和单糖转化为4-deoxy-l-erythro-5-hexoseuloseuronate(DEH)是生产生物乙醇的关键步骤。在目前的研究中，大多数外切型褐藻胶裂解酶都能产生不饱和单糖产物，但低的外切酶活性成为限速步骤。因此，寻找一种能产生单糖的内切型褐藻胶裂解酶成为高效生产生物乙醇的研究方向。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种内切型褐藻胶裂解酶及其编码基因和应用。本专利技术所述的内切型褐藻胶裂解酶不仅能产单糖，还具有广泛的底物适应性、适冷性，该酶酶活强，具有较高的降解活性。为实现上述专利技术目的，本专利技术采用以下技术方案予以实现：本专利技术提供了一种内切型褐藻胶裂解酶TsAly7C，所述内切型褐藻胶裂解酶TsAly7C的氨基酸序列如SEQIDNo.7所示。进一步的，所述内切型褐藻胶裂解酶TsAly7C的氨基酸序列中包含如SEQIDNo.6所示的催化区的氨基酸序列。进一步的，所述内切型褐藻胶裂解酶TsAly7C的降解方式为内切型。进一步的，所述内切型褐藻胶裂解酶TsAly7C的适合反应温度为20℃-30℃。进一步的，所述内切型褐藻胶裂解酶TsAly7C的最适反应温度为30℃。进一步的，所述内切型褐藻胶裂解酶TsAly7C的适合反应pH为7.7-8.9。进一步的，所述内切型褐藻胶裂解酶TsAly7C的最适反应pH为8.0。进一步的，所述内切型褐藻胶裂解酶TsAly7C在pH6.6-9.3具有很好的稳定性。进一步的，所述内切型褐藻胶裂解酶TsAly7C在0-30℃下具有很好的稳定性。进一步的，所述内切型褐藻胶裂解酶TsAly7C的适合反应NaCl浓度为0.2-0.4M。进一步的，所述内切型褐藻胶裂解酶TsAly7C的最适反应NaCl浓度为0.3M。进一步的，Fe3+和Ca2+促进所述内切型褐藻胶裂解酶TsAly7C的酶活；Cu2+、Co2+、Zn2+、Ni2+、SDS和EDTA抑制所述内切型褐藻胶裂解酶TsAly7C的酶活。进一步的，所述内切型褐藻胶裂解酶TsAly7C具有广泛的底物适应性，能够显著降解褐藻胶、polyM和polyG。进一步的，所述内切型褐藻胶裂解酶TsAly7C的最终降解产物为饱和褐藻胶单糖、不饱和褐藻胶单糖和不饱和褐藻胶二糖。本专利技术还提供了所述的内切型褐藻胶裂解酶TsAly7C的编码基因，所述编码基因的核苷酸序列如SEQIDNo.1所示，其中包含如SEQIDNo.5所示的催化区的核苷酸序列。本专利技术还提供了包含所述的内切型褐藻胶裂解酶TsAly7C的编码基因的重组表达载体。进一步的，所述重组表达载体为pET-24a(+)载体。本专利技术还提供了包含所述的内切型褐藻胶裂解酶TsAly7C的编码基因的重组菌株。进一步的，所述重组菌株为大肠杆菌BL21(DE3)。进一步的，所述的内切型褐藻胶裂解酶TsAly7C的制备方法为：将所述重组菌株接种到含有卡那霉素的液体LB培养基中37℃摇床培养，培养至OD600为0.4~0.6时，加入IPTG使其终浓度为0.25mM，18℃诱导48h；菌体离心去上清，沉淀重悬后破碎，再离心收集上清液得到粗酶液；使用镍离子亲和柱将粗酶液分离纯化获得所述内切型褐藻胶裂解酶TsAly7C。本专利技术还提供了所述的内切型褐藻胶裂解酶TsAly7C在用于制备降解海洋多糖的生物酶制剂中的应用。进一步的，所述内切型褐藻胶裂解酶TsAly7C的使用量为30U/mg-50U/mg。进一步的，所述内切型褐藻胶裂解酶TsAly7C能够显著降解褐藻胶、polyM和polyG。本专利技术还提供了所述的内切型褐藻胶裂解酶TsAly7C在用于生产褐藻胶单糖和/或褐藻胶二糖中的应用。与现有技术相比，本专利技术的优点和技术效果是：本专利技术所述的内切型褐藻胶裂解酶TsAly7C可以利用含有TsAly7C编码基因的重组菌体通过培养、诱导和分离纯化获得；该酶的最适反应温度30℃，且在0-30℃下具有良好的稳定性，因此该酶属于一种冷适应的褐藻胶裂解酶，能够在低温下有效降解底物，并且该酶的降解方式为内切型，最终降解产物为饱和褐藻胶单糖、不饱和褐藻胶单糖和不饱和褐藻胶二糖。另外，所述内切型褐藻胶裂解酶TsAly7C的最适pH为8.0，在pH6.6-9.3具有较好的稳定性，其同时具有广泛的底物降解性，能够降解褐藻胶、polyG和polyM，并且具有很高的比活力，而且所述内切型褐藻胶裂解酶TsAly7C对褐藻胶降解速率高，能够快速产生不饱和单糖，可用于DEH的生产。本专利技术还构建了含上述内切型褐藻胶裂解酶TsAly7C的重组载体和重组菌株并且确定了其酶学性质和降解速率，能够为工业化应用和生产生物乙醇提供了良好的基础。附图说明图1：内切型褐藻胶裂解酶TsAly7C表达纯化的聚丙烯酰胺凝胶电泳图（1，pET-24a(+)空载体；2，细菌破碎液；3，细菌破碎离心后上清液；4，TsAly7C纯酶）。图2：pH对所述内切型褐藻胶裂解酶TsAly7C的影响结果（A，不同反应pH对酶活力的影响；B，酶的pH稳定性）。图3：温度对所述内切型褐藻胶裂解酶TsAly7C的影响结果（A，不同反应温度对酶活力的影响；B，酶的温度稳定性）。图4：所述内切型褐藻胶裂解酶TsAly7C的底物偏好性结果。图5：所述内切型褐藻胶裂解酶TsAly7C的降解方式结果（A，乌氏粘度计结果；B，时程实验结果）。图6：所述内切型褐藻胶裂解酶TsAly7C的最终降解产物结果（A，凝胶过滤色谱结果；B，阴离子电喷雾离子化质谱结果-单糖；C，阴离子电喷雾离子本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种内切型褐藻胶裂解酶TsAly7C，其特征在于，所述内切型褐藻胶裂解酶TsAly7C的氨基酸序列如SEQ ID No.7所示。/n

【技术特征摘要】
1.一种内切型褐藻胶裂解酶TsAly7C，其特征在于，所述内切型褐藻胶裂解酶TsAly7C的氨基酸序列如SEQIDNo.7所示。


2.根据权利要求1所述的内切型褐藻胶裂解酶TsAly7C，其特征在于，所述内切型褐藻胶裂解酶TsAly7C的氨基酸序列中包含如SEQIDNo.6所示的催化区的氨基酸序列。


3.根据权利要求1所述的内切型褐藻胶裂解酶TsAly7C，其特征在于，所述内切型褐藻胶裂解酶TsAly7C的降解方式为内切型，并能够显著降解褐藻胶、polyM和polyG。


4.根据权利要求1所述的内切型褐藻胶裂解酶TsAly7C，其特征在于，所述内切型褐藻胶裂解酶TsAly7C的适合反应温度为20℃-30℃，适合反应pH为7.7-8.9。


5.权利要求1所述的内切型褐藻胶裂解酶TsAly7C的...

【专利技术属性】
技术研发人员：于文功，韩峰，孙家霞，王海楠，傅政，
申请(专利权)人：中国海洋大学，
类型：发明
国别省市：山东;37