一种提取急性心肌梗塞患者血栓外泌体的方法及应用技术

本发明专利技术涉及一种提取急性心肌梗塞患者血栓外泌体的方法及应用，使用胶原酶混合胰酶的方法溶解血栓后使用超速离心法成功提取血栓内的外泌体，这在国内外尚属首例，并经过对比已有的胶原酶法提取组织外泌体，本发明专利技术在加入胰酶后，减少了胶原酶用量的同时，还提高了外泌体纯度。

【技术实现步骤摘要】
一种提取急性心肌梗塞患者血栓外泌体的方法及应用
本专利技术涉及医药
，具体涉及一种提取急性心肌梗塞患者血栓外泌体的方法及应用。
技术介绍
心肌梗死又叫心肌梗塞，心肌梗塞(myocardialinfarction)是冠状动脉闭塞，血流中断，使部分心肌因严重的持久性缺血而发生局部坏死。临床上有剧烈而较持久的胸骨后疼痛，发热、白细胞增多、红细胞沉降率加快，血清心肌酶活力增高及进行性心电图变化，可发生心律失常、休克或心力衰竭。急性心肌梗死发病突然，应及早发现，及早治疗，并加强入院前处理。治疗原则为挽救濒死的心肌，缩小梗死面积，保护心脏功能，及时处理各种并发症。目前国内外的研究均是基于某种特定细胞来源的外泌体或循环血中的外泌体进行相关研究，但急性心肌梗死局部由于血栓堵塞冠状动脉这一特殊病理生理情况，故而局部微环境可能与循环血有一定差异性，且血栓的组分复杂，并非单一细胞系，故而当前的常规外泌体研究体系并不适用。而既往Vella等人的报道(VellaLJ,SciclunaBJ,ChengL,etal.Arigorousmethodtoenrichforexosomesfrombraintissue.JExtracellVesicles.2017.6(1):1348885.)证实，通过胶原蛋白酶及胰酶混合溶解大脑组织，进而提出组织外泌体。本研究基于该报道并经过改进，使用胶原酶混合胰酶的方法溶解血栓后使用超速离心法成功提取血栓内的外泌体，这在国内外尚属首例，并经过对比已有的胶原酶法提取组织外泌体，本专利技术在加入胰酶后，减少了胶原酶用量的同时，还提高了外泌体纯度。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种提取急性心肌梗塞患者血栓外泌体的方法。本专利技术的另一目的是提供一种外泌体在制备治疗急性心肌梗塞疾病药物中的应用。本专利技术所述一种提取急性心肌梗塞患者血栓外泌体的方法为：S1:取成人心肌梗死后冠脉血栓至装有5-10ml磷酸盐缓冲液(phosphatebuffersaline，PBS)的15ml离心管中静置过夜；S2:加入胰酶和II型胶原酶；S3:充分震荡混匀后，置于37℃恒温摇床4h直至血栓完全溶解；S4:去除非凝固状态的血液，随后吸取上清液丢弃，取沉淀的血栓90-110mg至装有4mlPBS的15ml离心管中备用；S5:将前述溶解后的血栓组织溶解液在高速离心机2-5℃、2000gX7-13min离心，去除溶解液里残留的死细胞和细胞碎片，取上清液待用；S6；将过滤除菌后的液体加入超速离心管2-5℃、120000gX60-80min超速离心；S7:弃上清，将沉淀以无菌PBS100ul重悬，即为外泌体。优选的，前述步骤S1静置过夜6h以上。优选的，前述步骤S2加入10-200μg/ml的胰酶。优选的，前述步骤S2加入20μg/ml的胰酶。优选的，前述步骤S2加入10-200U/mlII型胶原酶。优选的，前述步骤S2加入50U/mlII型胶原酶。优选的，前述步骤S4取沉淀的血栓100mg至装有4mlPBS的15ml离心管中备用。优选的，前述溶解后的血栓组织溶解液在高速离心机4℃、2000gX10min离心，去除溶解液里残留的死细胞和细胞碎片，取上清液待用。优选的，前述步骤S6将过滤除菌后的液体加入超速离心管4℃、120000gX70min超速离心。本专利技术所述方法而得外泌体在制备治疗急性心肌梗塞疾病药物中的应用。有益效果：专利技术与现有技术相比，具有以下有益效果：现有技术的问题：目前国内外的研究均是基于某种特定细胞来源的外泌体或循环血中的外泌体进行相关研究，但急性心肌梗死局部由于血栓堵塞冠状动脉这一特殊病理生理情况，故而局部微环境可能与循环血有一定差异性，且血栓的组分复杂，并非单一细胞系，因此当前的常规外泌体研究体系并不适用。本专利技术有益效果：本专利技术使用胶原酶混合胰酶的方法溶解血栓后使用超速离心法成功提取血栓内的外泌体，在国内外尚属首例，并经过对比已有的胶原酶法提取组织外泌体，本专利技术在加入胰酶后，减少了胶原酶用量的同时，还提高了外泌体纯度。附图说明图1：各组血栓溶解图：A：0min时各组血栓情况；B：15min时各组血栓情况；C：30min时各组血栓情况；D：45min时各组血栓情况；E：1h时各组血栓情况。图2：各组血栓溶解剩余质量统计图(1)。图3：圆圈所示的白色沉淀物质即为超速离心后沉淀的外泌体。图4：A：WB鉴定各组外泌体标记物CD36以及内参GAPDH，B：各组WB灰度值统计数据。图5：各组血栓溶解液提取外泌体电镜图：A：①组小剂量胰酶(10μg/ml)+小剂量II型胶原酶(10U/ml)组、B：②组：小剂量II型胶原酶+大剂量胰酶组、C：③组：胰酶+II型胶原酶组、D：④组：大剂量II型胶原酶+大剂量胰酶组、E：⑤组：大剂量II型胶原酶+小剂量胰酶组。图中可见各组中外泌体呈标准的中间凹陷的圆盘状，大小在50-200nm之间。图6：各组血栓溶解液提取外泌体NTA结果图：A：①组小剂量胰酶(10μg/ml)+小剂量II型胶原酶(10U/ml)组，结果可见外泌体峰值主要在123.6nm、154.2nm、191.2nm，随后有一个峰值集中在226.9nm；B：②组：小剂量II型胶原酶+大剂量胰酶组，结果可见外泌体峰值主要在132.3nm、161nm、192nm，随后有一个峰值集中在242.5nm；C：③组：胰酶+II型胶原酶组：结果可见外泌体峰值主要在127.8nm、174.2nm、106.9nm，随后有一个峰值集中在236.9nm；D：④组：大剂量II型胶原酶+大剂量胰酶组：结果可见外泌体峰值主要在140.7nm、167.2nm、68nm，该组无超过200nm的峰值；E：⑤组：大剂量II型胶原酶+小剂量胰酶组：结果可见外泌体峰值主要在135.5nm、167.3nm、114.4nm，该组无超过200nm的峰值。图7：各组血栓溶解图：A：0min时各组血栓情况；B：15min时各组血栓情况；C：30min时各组血栓情况；D：1h时各组血栓情况。图8：各组血栓溶解剩余质量统计图(2)。图9：A：WB鉴定各组外泌体标记物CD36及内参GAPDH。B：各组WB灰度值统计数据。图10：各组外泌体电镜检测结果图，图A为胶原酶组，B为阿替普酶组，C为胰酶+胶原酶组。图中可见各组中外泌体呈标准的中间凹陷的圆盘状，大小在50-200nm之间。图11：各组外泌体NTA检测结果图。图A：胶原酶组，可见外泌体最高峰值出现在127.1nm，但在210.8nm之后仍有峰值，提示纯度相对较低。B：阿替普酶组，可见外泌体最高峰值出现在136.7nm和177nm，但在243nm及202.6nm处仍有峰值，提示纯度相对较低。C：胰酶+胶原酶组，可见外泌体峰值在200nm以内，最高峰出现在127.8本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种提取急性心肌梗塞患者血栓外泌体的方法，其特征在于，所述提取方法为：/nS1:取成人心肌梗死后冠脉血栓至装有5-10ml磷酸盐缓冲液的15ml离心管中静置过夜；/nS2:加入胰酶和II型胶原酶；/nS3:充分震荡混匀后，置于37℃恒温摇床4h直至血栓完全溶解；/nS4:去除非凝固状态的血液，随后吸取上清液丢弃，取沉淀的血栓90-110mg至装有4mlPBS的15ml离心管中备用；/nS5:将前述溶解后的血栓组织溶解液在高速离心机2-5℃、2000gX 7-13min离心，去除溶解液里残留的死细胞和细胞碎片，取上清液待用；/nS6；将过滤除菌后的液体加入超速离心管2-5℃、120000gX 60-80min超速离心；/nS7:弃上清，将沉淀以无菌PBS 100ul重悬，即为外泌体。/n

【技术特征摘要】
1.一种提取急性心肌梗塞患者血栓外泌体的方法，其特征在于，所述提取方法为：
S1:取成人心肌梗死后冠脉血栓至装有5-10ml磷酸盐缓冲液的15ml离心管中静置过夜；
S2:加入胰酶和II型胶原酶；
S3:充分震荡混匀后，置于37℃恒温摇床4h直至血栓完全溶解；
S4:去除非凝固状态的血液，随后吸取上清液丢弃，取沉淀的血栓90-110mg至装有4mlPBS的15ml离心管中备用；
S5:将前述溶解后的血栓组织溶解液在高速离心机2-5℃、2000gX7-13min离心，去除溶解液里残留的死细胞和细胞碎片，取上清液待用；
S6；将过滤除菌后的液体加入超速离心管2-5℃、120000gX60-80min超速离心；
S7:弃上清，将沉淀以无菌PBS100ul重悬，即为外泌体。


2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S1静置过夜6h以上。


3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S2加入10-200μg/ml的胰酶。
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【专利技术属性】
技术研发人员：何尤夫，吴强，钱宇，艾丽琼，周瑜，黄晶，龙向淑，蒙宣彤，
申请(专利权)人：贵州省人民医院，
类型：发明
国别省市：贵州;52